Caracterización parcial de vitelogenina de Chelonia mydas agassizii y validación de un ensayo inmunoenzimático (elisa) para su detección en plasma como potencial biomarcador de xenoestrógenos

Abstract

Las siete tortugas marinas que existen en el mundo son consideradas amenazadas o en peligro de extinción, incluyendo a la tortuga prieta Chelonia mydas agassizii. Indudablemente ciertas actividades humanas como la sobre pesca y la pesca incidental han sido la causa de este colapso. En los últimos años ha incrementado la preocupación por ciertos productos químicos que son liberados al ambiente como pesticidas y detergentes. Estos compuestos conocidos como xenoestrógenos tienen la habilidad de mimetizar la acción de la hormona 17β-estradiol (E2). El impacto de estos contaminantes en el éxito reproductivo de la fauna silvestre es considerado crítico especialmente en organismos en peligro de extinción. La vitelogenina (VTG) es una proteína compleja que se sintetiza en todos los vertebrados ovíparos siendo los estrógenos el principal estímulo para su síntesis y secreción. Esta producción esta normalmente restringida a hembras adultas, sin embargo, su síntesis puede ser inducida en machos y hembras inmaduras por la exposición a xenoestrógenos, características que hacen de esta proteína un biomarcador ideal. El presente trabajo reporta la caracterización de VTG de C. mydas agassizzi y la subsecuente validación de un ensayo inmunoenzimático (ELISA) para su detección en plasma. La VTG se purificó de plasma de machos inducidos con E2 por medio de cromatografía de intercambio iónico. La proteína aislada, ausente en el plasma de macho antes de la inducción (control), se identificó como VTG por su naturaleza glico-lipo-proteica y por la homología de su secuencia de aminoácidos con VTG de otros vertebrados. Se caracterizó como un dímero de aproximadamente 500 kDa compuesto de dos monómeros de igual peso molecular de aproximadamente 200 kDa. La VTG purificada se utilizó como antígeno en la elaboración de anticuerpos policlonales cuyo alto título y especificidad se comprobó por ELISA y Western blot respectivamente. La sensibilidad del ELISA desarrollado se estimó entre 15 ng/ml y 2 µg/ml, el coeficiente de variación entre y dentro del ensayo fue menor al 8 y 10%, respectivamente, indicando su precisión. Se encontró paralelismo entre la curva estándar y las curvas generadas con diluciones de plasma inducido, además se determinó 1:5000, como la dilución en la que el efecto matriz se reduce. Se observó reacción cruzada del antisuero generado con VTG de Caretta caretta y Eretmochelys imbricata, lo cual amplía la aplicabilidad del ensayo con otras especies de tortuga marina. El empleo de este ensayo como parte de un programa de valoración del estado de salud de la tortuga prieta C. mydas agassizii, podrá contribuir al entendimiento de los factores que están influyendo en la lenta recuperación de esta especie y dar una pauta para atacar el problema desde otra perspectiva.