Vitelogénesis de la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (von Martens, 1868; Decapoda: Parastacidae). Caracterización de las moléculas vitelinas y determinación del lugar de síntesis de la Vitelogenina

Abstract

La vitelogenina (Vg) de la hemolinfa y las vitelinas (Vts) del ovario y de diferentes estadios de desarrollo en huevos de la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus fueron analizados mediante diversas técnicas de electroforesis PAGE, SDS-PAGE y cromatografía. Con estos métodos, en la hemolinfa de hembras en estado de vitelogénesis secundaria, una posible Vg fue encontrada con una masa molecular nativa de 500 kDa. En ovarios y en huevos en estadios I y V, dos formas de Vts (Vt1 y Vt2) fueron observados. En ovarios en vitelogénesis secundaria, la masa molecular nativa fue de 470 kDa (Vt1) y 440 kDa (Vt2). Los huevos en diversos estadios de desarrollo, mostraron un patrón electroforético más complejo, consistente en proteínas con diferentes masas moleculares; en huevos en estadio I, la masa molecular nativa fue de 650 kDa (Vt1) y 440 kDa (Vt2) y huevos en estadio V, la masa molecular nativa fue de 390 kDa (Vt1) y 340 kDa (Vt2). La composición bioquímica de las Vts mostró que se tratan de lipo-glico-proteínas. En el análisis SDS-PAGE una similar composición polipeptídica fue observada en las dos formas de Vts en el ovario y en los huevos en estadio V. En los ovarios, el análisis mostró 4 subunidades con masas moleculares alrededor de 180, 120, 95, y 80 kDa (Vt1 y Vt2) y en huevos en estadio V, masas moleculares de 110, 95, 87, y 75 kDa (Vt1 y Vt2). La composición polipeptídica en las dos Vts en huevos en estadio I y en estadio III fue diferente: 195, 190, 130, y 110 kDa (Vt1) y 116 y 107 kDa (Vt2). En huevos en estadio V fueron también identificadas dos formas de Vts mediante cromatografía en columnas de Sepharose CL-2B y de hidroxilapatita. Dos anticuerpos antivitelina (Ac1 y Ac2) fueron preparados a partir de electroforesis preparativas de extracto de huevos en estadio V y su especificidad fue demostrada por el análisis ELISA, doble inmunodifusión radial y Western blot. Un producto de PCR de 1.1 Kb fue obtenido utilizando ADN genómico de C. quadricarinatus como molde. Se diseñaron oligonucleótidos cebadores a partir del ADNc de la Vg del hepatopáncreas de la misma especie. El producto de PCR fue clonado, secuenciado y se utilizó como sonda para hibridar en el análisis de Northern blot. El ARN total del hepatopáncreas y del ovario de hembras en vitelogénesis secundaria de primera maduración fue extraído y utilizado como molde para la obtención de su correspondiente ADNc por transcripción reversa (RT). Los resultados del análisis del Northern blot mostraron que el ARNm de la Vg estuvo presente en el ovario como en el hepatopáncreas, no detectándose en el hepatopáncreas de machos maduros de la misma especie. Los resultados de RT-PCR mostraron que el ARNm que codifica la región 3’ del ADNc de la Vg estuvo presente también simultáneamente en ambos tejidos. Asimismo, se sugiere la presencia de más de un gen que codifican la síntesis de la Vg.