Serin-proteinasas y sus inhibidores en la respuesta inmune del camarón blanco (Penaeus vannamei)

Abstract

Los camarones son organismos capaces de combatir exitosamente a los patógenos. Aunque la especificidad de su sistema inmune parece estar limitada, son capaces de diferenciar lo propio y lo extraño, respondiendo a través de mecanismos celulares y humorales, los cuales pueden combinarse para constituir sistemas multiméricos, como el sistema de activación de la profenoloxidasa (proFO) y el sistema de coagulación. Ambos sistemas están constituidos por cascadas enzimáticas donde las proteinasas tienen un papel decisivo en la activación. Sin embargo, la actividad proteolítica debe ser mantenida dentro de parámetros fisiológicos para evitar daños tisulares. Por ello, las proteinasas y sus inhibidores, han sido considerados como parte importante en el control de la respuesta inmune. Utilizando macroarreglos de un banco de cDNA de hemocitos de camarón, fue posible la identificación de clones codificantes para serin proteinasas, inhibidores tipo Kazal y proteínas tipo WAP. Los insertos fueron secuenciados y se buscó establecer variaciones en su expresión en respuesta a la inoculación de Vibrio alginolyticus. Además del dominio proteolítico, las serin proteinasas de hemocitos de crustáceos, característicamente, contienen un dominio llamado clip. Se encontró un clon codificante para una serin proteinasa que contiene un dominio clip incompleto, el cual es similar a otros reportados en insectos. Del mismo modo, se caracterizó el inserto de un clon conteniendo la región codificante parcial para otra serin-proteinasa, la cual tiene Gly en lugar de Ser en su sitio catalítico. Este tipo de serin proteinasas homólogas han sido reportadas en artrópodos. Los inhibidores de proteinasas del tipo Kazal han sido descritos como proteínas de bajo peso molecular caracterizados por un dominio de 6 cisteínas. Las proteínas pueden contener varios dominios, aunque no todos con actividad inhibitoria. Un clon codificante para una proteína conteniendo 4 dominios Kazal fue aislado del banco de genes de hemocitos de camarón. Por su secuencia de aminoácidos deducida se pudo predecir que el tercer dominio inhibe subtilisina y el cuarto tripsina, sin embargo los dos primeros parecen no tener actividad. Otros inhibidores de proteinasas poseen un domino WAP (Whey acidic protein) y algún otro dominio (por ejemplo, Kunitz, trapping, cem). Del banco de genes de hemocitos de camarón, se aisló un clon codificante para una proteína conteniendo un dominio WAP. Sin embargo, esta proteína esta constituida únicamente por un dominio WAP, siendo el primer caso en invertebrados. Así mismo, se encontró otro clon codificante para una proteína que contiene dos dominios WAP. Diferencias en los niveles de expresión de los genes codificantes para las proteinasas y sus inhibidores por la inoculación de Vibrio alginolyticus, fue confirmada por RT-PCR. El inhibidor de tipo Kazal y la proteína conteniendo dos dominios WAP aumenta sus niveles 0.1 veces a las 6 h, disminuyendo 50% a las 12 y 24 h. Por otro lado, la proteína conteniendo un dominio WAP y la serin-proteinasa homóloga aumenta sus niveles en 2 y 3 veces a las 6 h, mientras que la expresión de la pseudo-clip serin-proteinasa no fue modificada. Aunque no se confirmó la actividad bioquímica, los resultados apoyan la idea que las serin-proteinasas y sus inhibidores se encuentran involucrados en la respuesta inmune del camarón.