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dc.contributor.advisorIbarra Humphries, Ana María
dc.contributor.advisorGarcía Gasca, Alejandra
dc.contributor.authorMorelos Castro, Rosa María
dc.date.issued2015es_MX
dc.identifier.urihttp://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/567
dc.description.abstractLa almeja mano de león, Nodipecten subnodosus, es el pectínido más grande de las costas del Pacífico en el continente Americano, con un músculo aductor de alto valor comercial. La miostatina es una proteína de la superfamilia de TGF-β cuya función en vertebrados es el control del crecimiento muscular. En este trabajo se aisló la secuencia completa del transcrito de la miostatina de Nodipecten subnodosus con fines de estudiar su participación en el crecimiento de esta especie. Se aisló un transcrito con un ORF de 1380 pb que codifica para una proteína de 459 aa con alta identidad a la previamente aislada en otros pectínidos, pero encontrando dos sitios de procesamiento proteolítico, el previamente reportado (RSKR) y un segundo en una posición 266-269 aa (RRKR), lo que es importante ya que la presencia de más de un sitio de procesamiento proteolítico en otras proteínas de la superfamilia de las TGF- β ha sido asociada con la posible generación de variantes y con mecanismos de señalización tisular de corto y largo alcance. Otro resultado no antes visto en pectínidos es que se identificaron dos UTR-5’s, los cuales presentan tamaños diferentes (234 y 57 pb); el análisis in silico mostró que la UTR-5’ más larga presenta una secuencia consenso tata-box (TATAAA) que explica el transcrito más corto ya que se localiza 27 pb antes del inicio del transcrito corto. La UTR-3’ contiene varios elementos cis-reguladores de la traducción, pero en particular se encontraron varias K-boxes, con una de ellas presente en todas las secuencias de mstn de pectínidos, infiriéndose que puede representar un sitio de reconocimiento de miRNAs. Finalmente, durante la caracterización del transcrito de la mstn se encontró un transcrito variante en diversos tejidos, el cual se infiere que es resultado de un splicing alternativo, el cual de ser traducido, daría lugar a una proteína trunca justo antes del sitio proteolítico que da lugar a la MSTN madura. A partir de la secuencia obtenida se realizaron varios estudios y experimentos en los que se evaluó por qPCR la expresión de la miostatina; debido a la presencia del splicing alterno, se evaluó la expresión de transcritos utilizando cebadores que amplifican solo transcritos sin el splicing (deleción) alterno así como ambos posibles transcritos (con y sin splicing). (I) En un primer estudio se evaluó por qPCR la expresión temporal de la miostatina en el músculo aductor durante un periodo de crecimiento en un sitio de baja disponibilidad de alimento como Bahía de Loreto, mostrando que la expresión presentó diferencias significativas entre meses (P<0.05), incrementando durante los meses de verano cuando tanto la biomasa como el peso del músculo aductor mostraron un decremento en su peso; esto se observó en paralelo a decrementos en la disponibilidad de alimento e incrementos de la temperatura del agua. El análisis puntual (Agosto) de expresión tisular indicó que la mayor expresión de la miostatina fue en el músculo aductor, seguido del manto y las branquias con diferencias significativas (P<0.05) con la gónada y la glándula digestiva. (II) En un segundo estudio se evaluó la expresión temporal de este gen en diferentes tejidos de la almeja (branquia, manto, gónada, glándula digestiva y músculo aductor) durante un ciclo de crecimiento en un sitio de alta productividad como es Rancho Bueno, encontrando que mientras que el músculo aductor presentó nuevamente su mayor expresión en Agosto posiblemente asociado con el posdesove como en el estudio de Bahía de Loreto, la expresión en otros tejidos como manto y branquia fue tan o más alta como la del músculo aductor en Abril y Octubre, permitiéndonos sugerir que este gen posiblemente tiene un rol adicional al de crecimiento muscular en Nodipecten subnodosus. Aunado a estos resultados, el análisis filogenético donde se agrupa a la MSTN de moluscos, la MYO de Drosophila spp. y la MSTN/GDF-11 de crustáceos, presenta evidencia suficiente para sugerir que en N. subnodosus la MSTN es ortóloga de la MSTN/GDF-11, descrita como una sola proteína en otras especies de invertebrados por la homología de la presunta MSTN con ambas proteínas en vertebrados y porque mientras que en vertebrados se encuentran dos genes, miostatina y gdf-11 con funciones diferentes, presuntamente derivados de una duplicación ancestral, en invertebrados solamente existe un gen. Dado que este gen se encontró expresado en otros tejidos como manto, se propone una función del mismo en el control del crecimiento de la concha, similarmente al papel que GDF-11 tiene en la biomineralización del hueso en vertebrados. Su función en branquia se desconoce. (III) En tercera instancia y con fines de complementar los resultados obtenidos con los estudios previos, se realizaron dos experimentos controlados de alimentación (alta y baja). El análisis de expresión de la miostatina, no presentó diferencias significativas entre el grupo de alto alimento y el grupo sometido a baja alimentación (P>0.05) para ninguno de los experimentos realizados durante el presente trabajo. Sin embargo, en el experimento de estrés nutricional con organismos de dos años de edad provenientes de Laguna Ojo de Liebre, la mayor expresión en ambos grupos experimentales fue en el músculo aductor, mientras que en el experimento donde se utilizaron organismos de aproximadamente un año de edad provenientes del Estero de Rancho Bueno la mayor expresión fue en el manto, corroborando los resultados de los estudios anteriores donde se encontró que la mstn se expresa en otros tejidos durante el crecimiento. La cuantificación por qPCR de las posibles variantes de la miostatina en N. subnodosus realizada en los diferentes análisis que se llevaron a cabo en el presente estudio, no mostró un patrón definido de expresión. Sin embargo, dada la expresión diferencial encontrada entre tejidos de esta especie podemos inferir que la expresión de las posibles variantes de la miostatina en esta especie son tejido específica y se van a expresar preferentemente bajo condiciones de estrés nutricional. (IV) Finalmente, la hibridación de un microarreglo heterólogo con ADNc de músculo aductor permitió observar el estado metabólico de los organismos de Ojo de Liebre que fueron sometidos a estrés nutricional, encontrando que los genes sobre- y sub-regulados de las rutas metabólicas como carbohidratos y lípidos fueron los más afectados, permitiendo inferir que estos organismos están haciendo uso de los triglicéridos como fuente de energía, posiblemente debido a que ya habían utilizado sus reservas de glucógeno durante la gametogénesis y desove que ocurrió en campo previo a realizar el experimento.es_MX
dc.language.isoIngleses_MX
dc.publisherCentro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.es_MX
dc.titleCaracterización del gen de la miostatina como un regulador negativo del crecimiento muscular en la almeja mano de león Nodipecten subnodosus y análisis de la expresión génica en el músculo aductor en respuesta a estrés nutricionales_MX
dc.typeTesises_MX
dc.documento.idmorelos_res_MX
dc.documento.instCIBNORes_MX
dc.dirtesis.gradoDoctorado en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturaleses_MX
dc.dirtesis.disciplinaAcuiculturaes_MX
dc.dirtesis.universidadCentro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.es_MX
dc.dirtesis.facultadPosgrado en Recursos Naturaleses_MX
dc.documento.fecha2001-07
dc.description.abstractenThe Pacific lion-paw, Nodipecten subnodosus, is the largest pectinid species in the Pacific coast of the American continent, and its adductor muscle is highly priced. Myostatin is a member of the TGF-β protein superfamily which controls muscle growth. In this work, the full sequence of the myostatin transcript from N. subnodosus was isolated to study its role in muscle growth regulation in this species. The transcript contains a 1380 bp ORF encoding for a 459 aa protein, showing high identity to previously isolated transcripts from other pectinids, but, in this case, finding two proteolytic-processing sites, the previously reported (RSKR), and a second one at 266-269 aa (RRKR), which is important since more than one proteolytic-processing site in other members from the TGF-β superfamily have been associated with transcription of variants and tissue signaling mechanisms at short and long range. Another result reported for the first time in pectinids is the identification of two 5’ UTRs of different size (234 and 57 bp); in silico analysis showed that the longer 5’ UTR contains a consensus tata-box sequence (TATAAA) 27 bp upstream the first base of the shorter transcript. The 3’ UTR contains several cis-acting elements for translation, particularly several K-boxes, one of them is present in all myostatin sequences from pectinids, suggesting that it represents a miRNA recognition site. Finally, during the characterization of the mstn transcript, a variant was found in several tissues, probably derived from alternative splicing which, in case it is translated, would produce a truncated protein just before the proteolytic site which is important to produce the mature protein. The expression of myostatin was analyzed in several experiments by qPCR; due to the presence of potential alternative-spliced variants, these were evaluated using different sets of primers; one set amplifies only the unspliced variant, while the other amplifies both variants. (I) In the first study, the temporal expression of myostatin in adductor muscle was measured by qPCR during a grow-out period in Bahia de Loreto, which is a site of low food availability, showing significant differences between months (P<0.05), increasing during the summer months when both biomass and adductor muscle weight decreased; in parallel food availability also decreased and water temperature increased. Tissue expression analysis in one month (August) indicated that the tissue with the highest expression of myostatin was the adductor muscle, followed by the mantle and gills with significant differences (P<0.05) with gonad and digestive gland. (II) In a second study, the temporal expression of myostatin was evaluated in different tissues (gills, mantle, gonad, digestive gland, and adductor muscle) during a grow-out period in Rancho Bueno, a site of high food availability. Again the highest expression was detected in the adductor muscle in August, probably associated to the post-spawning stage as in Bahia de Loreto; expression in other tissues such as mantle and gills was as high as or even higher than adductor muscle in April and October, suggesting additional roles for myostatin, other than the regulation of muscle growth in N. subnodosus. Together with these results, the phylogenetic analysis grouping MSTN from mollusks, MYO from Drosophila spp, and MSTN/GDF-11 from crustaceans shows that N. subnodosus MSTN is an orthologue of MSTN/GDF-11, described as a single protein for other invertebrate species, this is because of the homology observed between putative MSTN and both vertebrate proteins; both genes (myostatin and GDF-11) in vertebrates perform different functions but are thought to derive from an ancestral duplication of the genome, therefore in vertebrates there is only one mstn gene. Since this gene was expressed in non-muscle tissues such as mantle, it may participate in shell formation, performing a GDF-11-like role in bone biomineralization in vertebrates. Its function in the gill is still unknown. (III) In order to complement the field results, two feeding experiments (high and low food ingest) were performed under controlled conditions. Myostatin expression analysis did not show significant differences between both food conditions (P>0.05) for any of the experiments. Nevertheless, the nutritional stress experiment in two year-old organisms from Laguna Ojo de Liebre showed higher expression in the adductor muscle in both experimental groups, while in one-year old organisms from Rancho Bueno the highest expression was detected in mantle, confirming previous results in which mstn is expressed in other tissues during the growth period. Quantification by qPCR of potential myostatin variants in N. subnodosus performed during this study did not show a specific expression pattern. However, given the differential expression observed in different tissues it is possible that the expression of splice variants is tissue-specific, mainly under nutritional stress conditions. (IV) Finally, the heterologous microarray hybridized with cDNA from adductor muscle showed the metabolic status of organisms from Ojo de Liebre under nutritional stress, finding up- and down-regulated genes involved in metabolic routes such as carbohydrates and lipids which were the most affected, suggesting that these organisms are using triglycerides as energy source, probably because they had used all glycogen reserves during gametogenesis and spawning which occurred in the field just before the experiment.es_MX
dc.documento.subjectNodipecten subnodosus, Genéticaes_MX


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    Esta colección contiene texto completo de las tesis de Maestría y Doctorado del Programa de Posgrado del CIBNOR.

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