dc.contributor.advisor | Ibarra Humphries, Ana María | |
dc.contributor.advisor | García Gasca, Alejandra | |
dc.contributor.author | Morelos Castro, Rosa María | |
dc.date.issued | 2015 | es_MX |
dc.identifier.uri | http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/567 | |
dc.description.abstract | La almeja mano de león, Nodipecten subnodosus, es el pectínido más grande de las costas del
Pacífico en el continente Americano, con un músculo aductor de alto valor comercial. La
miostatina es una proteína de la superfamilia de TGF-β cuya función en vertebrados es el
control del crecimiento muscular. En este trabajo se aisló la secuencia completa del transcrito
de la miostatina de Nodipecten subnodosus con fines de estudiar su participación en el
crecimiento de esta especie. Se aisló un transcrito con un ORF de 1380 pb que codifica para
una proteína de 459 aa con alta identidad a la previamente aislada en otros pectínidos, pero
encontrando dos sitios de procesamiento proteolítico, el previamente reportado (RSKR) y un
segundo en una posición 266-269 aa (RRKR), lo que es importante ya que la presencia de
más de un sitio de procesamiento proteolítico en otras proteínas de la superfamilia de las TGF-
β ha sido asociada con la posible generación de variantes y con mecanismos de señalización
tisular de corto y largo alcance. Otro resultado no antes visto en pectínidos es que se
identificaron dos UTR-5’s, los cuales presentan tamaños diferentes (234 y 57 pb); el análisis in
silico mostró que la UTR-5’ más larga presenta una secuencia consenso tata-box (TATAAA)
que explica el transcrito más corto ya que se localiza 27 pb antes del inicio del transcrito corto.
La UTR-3’ contiene varios elementos cis-reguladores de la traducción, pero en particular se
encontraron varias K-boxes, con una de ellas presente en todas las secuencias de mstn de
pectínidos, infiriéndose que puede representar un sitio de reconocimiento de miRNAs.
Finalmente, durante la caracterización del transcrito de la mstn se encontró un transcrito
variante en diversos tejidos, el cual se infiere que es resultado de un splicing alternativo, el cual
de ser traducido, daría lugar a una proteína trunca justo antes del sitio proteolítico que da lugar
a la MSTN madura. A partir de la secuencia obtenida se realizaron varios estudios y
experimentos en los que se evaluó por qPCR la expresión de la miostatina; debido a la
presencia del splicing alterno, se evaluó la expresión de transcritos utilizando cebadores que
amplifican solo transcritos sin el splicing (deleción) alterno así como ambos posibles transcritos
(con y sin splicing). (I) En un primer estudio se evaluó por qPCR la expresión temporal de la
miostatina en el músculo aductor durante un periodo de crecimiento en un sitio de baja
disponibilidad de alimento como Bahía de Loreto, mostrando que la expresión presentó
diferencias significativas entre meses (P<0.05), incrementando durante los meses de verano
cuando tanto la biomasa como el peso del músculo aductor mostraron un decremento en su
peso; esto se observó en paralelo a decrementos en la disponibilidad de alimento e
incrementos de la temperatura del agua. El análisis puntual (Agosto) de expresión tisular indicó
que la mayor expresión de la miostatina fue en el músculo aductor, seguido del manto y las
branquias con diferencias significativas (P<0.05) con la gónada y la glándula digestiva. (II) En
un segundo estudio se evaluó la expresión temporal de este gen en diferentes tejidos de la
almeja (branquia, manto, gónada, glándula digestiva y músculo aductor) durante un ciclo de
crecimiento en un sitio de alta productividad como es Rancho Bueno, encontrando que
mientras que el músculo aductor presentó nuevamente su mayor expresión en Agosto
posiblemente asociado con el posdesove como en el estudio de Bahía de Loreto, la expresión
en otros tejidos como manto y branquia fue tan o más alta como la del músculo aductor en
Abril y Octubre, permitiéndonos sugerir que este gen posiblemente tiene un rol adicional al de crecimiento muscular en Nodipecten subnodosus. Aunado a estos resultados, el análisis
filogenético donde se agrupa a la MSTN de moluscos, la MYO de Drosophila spp. y la
MSTN/GDF-11 de crustáceos, presenta evidencia suficiente para sugerir que en N.
subnodosus la MSTN es ortóloga de la MSTN/GDF-11, descrita como una sola proteína en
otras especies de invertebrados por la homología de la presunta MSTN con ambas proteínas
en vertebrados y porque mientras que en vertebrados se encuentran dos genes, miostatina y
gdf-11 con funciones diferentes, presuntamente derivados de una duplicación ancestral, en
invertebrados solamente existe un gen. Dado que este gen se encontró expresado en otros
tejidos como manto, se propone una función del mismo en el control del crecimiento de la
concha, similarmente al papel que GDF-11 tiene en la biomineralización del hueso en
vertebrados. Su función en branquia se desconoce. (III) En tercera instancia y con fines de
complementar los resultados obtenidos con los estudios previos, se realizaron dos
experimentos controlados de alimentación (alta y baja). El análisis de expresión de la
miostatina, no presentó diferencias significativas entre el grupo de alto alimento y el grupo
sometido a baja alimentación (P>0.05) para ninguno de los experimentos realizados durante el
presente trabajo. Sin embargo, en el experimento de estrés nutricional con organismos de dos
años de edad provenientes de Laguna Ojo de Liebre, la mayor expresión en ambos grupos
experimentales fue en el músculo aductor, mientras que en el experimento donde se utilizaron
organismos de aproximadamente un año de edad provenientes del Estero de Rancho Bueno la
mayor expresión fue en el manto, corroborando los resultados de los estudios anteriores donde
se encontró que la mstn se expresa en otros tejidos durante el crecimiento. La cuantificación
por qPCR de las posibles variantes de la miostatina en N. subnodosus realizada en los
diferentes análisis que se llevaron a cabo en el presente estudio, no mostró un patrón definido
de expresión. Sin embargo, dada la expresión diferencial encontrada entre tejidos de esta
especie podemos inferir que la expresión de las posibles variantes de la miostatina en esta
especie son tejido específica y se van a expresar preferentemente bajo condiciones de estrés
nutricional. (IV) Finalmente, la hibridación de un microarreglo heterólogo con ADNc de músculo
aductor permitió observar el estado metabólico de los organismos de Ojo de Liebre que fueron
sometidos a estrés nutricional, encontrando que los genes sobre- y sub-regulados de las rutas
metabólicas como carbohidratos y lípidos fueron los más afectados, permitiendo inferir que
estos organismos están haciendo uso de los triglicéridos como fuente de energía,
posiblemente debido a que ya habían utilizado sus reservas de glucógeno durante la
gametogénesis y desove que ocurrió en campo previo a realizar el experimento. | es_MX |
dc.language.iso | Ingles | es_MX |
dc.publisher | Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. | es_MX |
dc.title | Caracterización del gen de la miostatina como un regulador negativo del crecimiento muscular en la almeja mano de león Nodipecten subnodosus y análisis de la expresión génica en el músculo aductor en respuesta a estrés nutricional | es_MX |
dc.type | Tesis | es_MX |
dc.documento.id | morelos_r | es_MX |
dc.documento.inst | CIBNOR | es_MX |
dc.dirtesis.grado | Doctorado en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales | es_MX |
dc.dirtesis.disciplina | Acuicultura | es_MX |
dc.dirtesis.universidad | Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. | es_MX |
dc.dirtesis.facultad | Posgrado en Recursos Naturales | es_MX |
dc.documento.fecha | 2001-07 | |
dc.description.abstracten | The Pacific lion-paw, Nodipecten subnodosus, is the largest pectinid species in the Pacific
coast of the American continent, and its adductor muscle is highly priced. Myostatin is a
member of the TGF-β protein superfamily which controls muscle growth. In this work, the
full sequence of the myostatin transcript from N. subnodosus was isolated to study its role
in muscle growth regulation in this species. The transcript contains a 1380 bp ORF
encoding for a 459 aa protein, showing high identity to previously isolated transcripts from
other pectinids, but, in this case, finding two proteolytic-processing sites, the previously
reported (RSKR), and a second one at 266-269 aa (RRKR), which is important since more
than one proteolytic-processing site in other members from the TGF-β superfamily have
been associated with transcription of variants and tissue signaling mechanisms at short
and long range. Another result reported for the first time in pectinids is the identification of
two 5’ UTRs of different size (234 and 57 bp); in silico analysis showed that the longer 5’
UTR contains a consensus tata-box sequence (TATAAA) 27 bp upstream the first base of
the shorter transcript. The 3’ UTR contains several cis-acting elements for translation,
particularly several K-boxes, one of them is present in all myostatin sequences from
pectinids, suggesting that it represents a miRNA recognition site. Finally, during the
characterization of the mstn transcript, a variant was found in several tissues, probably
derived from alternative splicing which, in case it is translated, would produce a truncated
protein just before the proteolytic site which is important to produce the mature protein.
The expression of myostatin was analyzed in several experiments by qPCR; due to the
presence of potential alternative-spliced variants, these were evaluated using different sets
of primers; one set amplifies only the unspliced variant, while the other amplifies both
variants. (I) In the first study, the temporal expression of myostatin in adductor muscle was
measured by qPCR during a grow-out period in Bahia de Loreto, which is a site of low food
availability, showing significant differences between months (P<0.05), increasing during
the summer months when both biomass and adductor muscle weight decreased; in
parallel food availability also decreased and water temperature increased. Tissue
expression analysis in one month (August) indicated that the tissue with the highest
expression of myostatin was the adductor muscle, followed by the mantle and gills with
significant differences (P<0.05) with gonad and digestive gland. (II) In a second study, the
temporal expression of myostatin was evaluated in different tissues (gills, mantle, gonad,
digestive gland, and adductor muscle) during a grow-out period in Rancho Bueno, a site of
high food availability. Again the highest expression was detected in the adductor muscle in
August, probably associated to the post-spawning stage as in Bahia de Loreto; expression
in other tissues such as mantle and gills was as high as or even higher than adductor
muscle in April and October, suggesting additional roles for myostatin, other than the
regulation of muscle growth in N. subnodosus. Together with these results, the
phylogenetic analysis grouping MSTN from mollusks, MYO from Drosophila spp, and
MSTN/GDF-11 from crustaceans shows that N. subnodosus MSTN is an orthologue of
MSTN/GDF-11, described as a single protein for other invertebrate species, this is
because of the homology observed between putative MSTN and both vertebrate proteins;
both genes (myostatin and GDF-11) in vertebrates perform different functions but are
thought to derive from an ancestral duplication of the genome, therefore in vertebrates there is only one mstn gene. Since this gene was expressed in non-muscle tissues such
as mantle, it may participate in shell formation, performing a GDF-11-like role in bone
biomineralization in vertebrates. Its function in the gill is still unknown. (III) In order to
complement the field results, two feeding experiments (high and low food ingest) were
performed under controlled conditions. Myostatin expression analysis did not show
significant differences between both food conditions (P>0.05) for any of the experiments.
Nevertheless, the nutritional stress experiment in two year-old organisms from Laguna Ojo
de Liebre showed higher expression in the adductor muscle in both experimental groups,
while in one-year old organisms from Rancho Bueno the highest expression was detected
in mantle, confirming previous results in which mstn is expressed in other tissues during
the growth period. Quantification by qPCR of potential myostatin variants in N.
subnodosus performed during this study did not show a specific expression pattern.
However, given the differential expression observed in different tissues it is possible that
the expression of splice variants is tissue-specific, mainly under nutritional stress
conditions. (IV) Finally, the heterologous microarray hybridized with cDNA from adductor
muscle showed the metabolic status of organisms from Ojo de Liebre under nutritional
stress, finding up- and down-regulated genes involved in metabolic routes such as
carbohydrates and lipids which were the most affected, suggesting that these organisms
are using triglycerides as energy source, probably because they had used all glycogen
reserves during gametogenesis and spawning which occurred in the field just before the
experiment. | es_MX |
dc.documento.subject | Nodipecten subnodosus, Genética | es_MX |