Caracterización del gen de la miostatina como un regulador negativo del crecimiento muscular en la almeja mano de león Nodipecten subnodosus y análisis de la expresión génica en el músculo aductor en respuesta a estrés nutricional

Abstract

La almeja mano de león, Nodipecten subnodosus, es el pectínido más grande de las costas del Pacífico en el continente Americano, con un músculo aductor de alto valor comercial. La miostatina es una proteína de la superfamilia de TGF-β cuya función en vertebrados es el control del crecimiento muscular. En este trabajo se aisló la secuencia completa del transcrito de la miostatina de Nodipecten subnodosus con fines de estudiar su participación en el crecimiento de esta especie. Se aisló un transcrito con un ORF de 1380 pb que codifica para una proteína de 459 aa con alta identidad a la previamente aislada en otros pectínidos, pero encontrando dos sitios de procesamiento proteolítico, el previamente reportado (RSKR) y un segundo en una posición 266-269 aa (RRKR), lo que es importante ya que la presencia de más de un sitio de procesamiento proteolítico en otras proteínas de la superfamilia de las TGF- β ha sido asociada con la posible generación de variantes y con mecanismos de señalización tisular de corto y largo alcance. Otro resultado no antes visto en pectínidos es que se identificaron dos UTR-5’s, los cuales presentan tamaños diferentes (234 y 57 pb); el análisis in silico mostró que la UTR-5’ más larga presenta una secuencia consenso tata-box (TATAAA) que explica el transcrito más corto ya que se localiza 27 pb antes del inicio del transcrito corto. La UTR-3’ contiene varios elementos cis-reguladores de la traducción, pero en particular se encontraron varias K-boxes, con una de ellas presente en todas las secuencias de mstn de pectínidos, infiriéndose que puede representar un sitio de reconocimiento de miRNAs. Finalmente, durante la caracterización del transcrito de la mstn se encontró un transcrito variante en diversos tejidos, el cual se infiere que es resultado de un splicing alternativo, el cual de ser traducido, daría lugar a una proteína trunca justo antes del sitio proteolítico que da lugar a la MSTN madura. A partir de la secuencia obtenida se realizaron varios estudios y experimentos en los que se evaluó por qPCR la expresión de la miostatina; debido a la presencia del splicing alterno, se evaluó la expresión de transcritos utilizando cebadores que amplifican solo transcritos sin el splicing (deleción) alterno así como ambos posibles transcritos (con y sin splicing). (I) En un primer estudio se evaluó por qPCR la expresión temporal de la miostatina en el músculo aductor durante un periodo de crecimiento en un sitio de baja disponibilidad de alimento como Bahía de Loreto, mostrando que la expresión presentó diferencias significativas entre meses (P<0.05), incrementando durante los meses de verano cuando tanto la biomasa como el peso del músculo aductor mostraron un decremento en su peso; esto se observó en paralelo a decrementos en la disponibilidad de alimento e incrementos de la temperatura del agua. El análisis puntual (Agosto) de expresión tisular indicó que la mayor expresión de la miostatina fue en el músculo aductor, seguido del manto y las branquias con diferencias significativas (P<0.05) con la gónada y la glándula digestiva. (II) En un segundo estudio se evaluó la expresión temporal de este gen en diferentes tejidos de la almeja (branquia, manto, gónada, glándula digestiva y músculo aductor) durante un ciclo de crecimiento en un sitio de alta productividad como es Rancho Bueno, encontrando que mientras que el músculo aductor presentó nuevamente su mayor expresión en Agosto posiblemente asociado con el posdesove como en el estudio de Bahía de Loreto, la expresión en otros tejidos como manto y branquia fue tan o más alta como la del músculo aductor en Abril y Octubre, permitiéndonos sugerir que este gen posiblemente tiene un rol adicional al de crecimiento muscular en Nodipecten subnodosus. Aunado a estos resultados, el análisis filogenético donde se agrupa a la MSTN de moluscos, la MYO de Drosophila spp. y la MSTN/GDF-11 de crustáceos, presenta evidencia suficiente para sugerir que en N. subnodosus la MSTN es ortóloga de la MSTN/GDF-11, descrita como una sola proteína en otras especies de invertebrados por la homología de la presunta MSTN con ambas proteínas en vertebrados y porque mientras que en vertebrados se encuentran dos genes, miostatina y gdf-11 con funciones diferentes, presuntamente derivados de una duplicación ancestral, en invertebrados solamente existe un gen. Dado que este gen se encontró expresado en otros tejidos como manto, se propone una función del mismo en el control del crecimiento de la concha, similarmente al papel que GDF-11 tiene en la biomineralización del hueso en vertebrados. Su función en branquia se desconoce. (III) En tercera instancia y con fines de complementar los resultados obtenidos con los estudios previos, se realizaron dos experimentos controlados de alimentación (alta y baja). El análisis de expresión de la miostatina, no presentó diferencias significativas entre el grupo de alto alimento y el grupo sometido a baja alimentación (P>0.05) para ninguno de los experimentos realizados durante el presente trabajo. Sin embargo, en el experimento de estrés nutricional con organismos de dos años de edad provenientes de Laguna Ojo de Liebre, la mayor expresión en ambos grupos experimentales fue en el músculo aductor, mientras que en el experimento donde se utilizaron organismos de aproximadamente un año de edad provenientes del Estero de Rancho Bueno la mayor expresión fue en el manto, corroborando los resultados de los estudios anteriores donde se encontró que la mstn se expresa en otros tejidos durante el crecimiento. La cuantificación por qPCR de las posibles variantes de la miostatina en N. subnodosus realizada en los diferentes análisis que se llevaron a cabo en el presente estudio, no mostró un patrón definido de expresión. Sin embargo, dada la expresión diferencial encontrada entre tejidos de esta especie podemos inferir que la expresión de las posibles variantes de la miostatina en esta especie son tejido específica y se van a expresar preferentemente bajo condiciones de estrés nutricional. (IV) Finalmente, la hibridación de un microarreglo heterólogo con ADNc de músculo aductor permitió observar el estado metabólico de los organismos de Ojo de Liebre que fueron sometidos a estrés nutricional, encontrando que los genes sobre- y sub-regulados de las rutas metabólicas como carbohidratos y lípidos fueron los más afectados, permitiendo inferir que estos organismos están haciendo uso de los triglicéridos como fuente de energía, posiblemente debido a que ya habían utilizado sus reservas de glucógeno durante la gametogénesis y desove que ocurrió en campo previo a realizar el experimento.