Construcción de una cepa de levadura productora de dsRNA específico contra el virus de la mancha blanca en camarón Litopenaeus vannamei

Abstract

Actualmente el síndrome del virus de la mancha blanca (WSSV) es, hasta el momento, la enfermedad más devastadora para el camarón de cultivo, causando mortalidades de hasta un 100% en un corto periodo de tiempo. Una potencial herramienta biotecnológica contra patógenos virales, es el RNA de interferencia (RNAi) mecanismo celular que es inducido por dsRNA. Actualmente, la producción del dsRNA in vitro es costosa e impráctica, por lo que, una alternativa es la producción de dsRNA en sistemas biológicos. El uso de levaduras como Yarrowia lipolytica confiere ventajas aprovechables para la producción del dsRNA. El objetivo de este trabajo fue generar una cepa de levadura productora de dsRNA específico contra WSSV y evaluar su actividad antiviral en el camarón Litopenaeus vannamei. Asimismo, se analizó in vitro la digestibilidad de la levadura Y. lipolytica y del dsRNA específico en el tracto digestivo del camarón con el fin de determinar si la pared celular es degradada para que esta levadura sea considerada como vehículo portador de dsRNA. Una construcción dsRNA-ORF89 en el plásmido pJC410 fue subclonada en el plásmido de expresión pRRQ-1 de Y. lipolytica resultando la cepa P01-AS. La producción de dsRNA-OFR89 se determinó por RT-PCR y qRT-PCR. Con el fin de aumentar la producción de dsRNA-ORF89 en P01-AS, se realizaron diferentes pruebas de shock térmico, cambios de pH y concentraciones de sales en diferentes medios. Además, se mutagenizó el gen Rnt1 de Y. lipolytica. La actividad antiviral del dsRNA-ORF89 se evaluó mediante un bioensayo reto. Se obtuvo una producción de 182 ng de dsRNA-ORF89 por litro a las 32 horas de cultivo celular de la cepa de levadura P01-AS. La expresión del gen Rnt1 fue mayor en medio de cultivo YPD, y menor en medio mínimo YNB, sin embargo, su producción se correlaciona con la densidad celular, observando una mayor expresión en medios con agua de mar. Para la mutación del gen Rnt1 con el casete de interrupción URA::Rnt1, no se observó crecimiento conspicuo de colonias, lo que sugiere que la mutación es letal. El bioensayo reto en camarones inoculados con WSSV y tratados con ARN total proveniente de la cepa P01-AS produjo una mortalidad acumulada del 75%, menor a la del control sin tratamiento (100%). Los análisis in vitro de digestibilidad indicaron que las enzimas de la glándula digestiva de camarón digieren las células de Y. lipolytica e hidrolizan el dsRNA-ORF89 a partir de los 30 min. La construcción de la cepa de levadura P01-AS genera la posibilidad de tener un modelo alternativo para la producción de dsRNA específico en un sistema in vivo, sin embargo, es necesario mejorar las condiciones de producción de dsRNA específico en esta cepa.