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dc.contributor.advisorMejía Ruiz, Claudio Humberto
dc.contributor.authorÁlvarez Sánchez, Ana Ruth
dc.date.issued2017es_MX
dc.identifierhttps://cibnor.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1001/439
dc.identifier.urihttp://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/565
dc.description.abstractActualmente el síndrome del virus de la mancha blanca (WSSV) es, hasta el momento, la enfermedad más devastadora para el camarón de cultivo, causando mortalidades de hasta un 100% en un corto periodo de tiempo. Una potencial herramienta biotecnológica contra patógenos virales, es el RNA de interferencia (RNAi) mecanismo celular que es inducido por dsRNA. Actualmente, la producción del dsRNA in vitro es costosa e impráctica, por lo que, una alternativa es la producción de dsRNA en sistemas biológicos. El uso de levaduras como Yarrowia lipolytica confiere ventajas aprovechables para la producción del dsRNA. El objetivo de este trabajo fue generar una cepa de levadura productora de dsRNA específico contra WSSV y evaluar su actividad antiviral en el camarón Litopenaeus vannamei. Asimismo, se analizó in vitro la digestibilidad de la levadura Y. lipolytica y del dsRNA específico en el tracto digestivo del camarón con el fin de determinar si la pared celular es degradada para que esta levadura sea considerada como vehículo portador de dsRNA. Una construcción dsRNA-ORF89 en el plásmido pJC410 fue subclonada en el plásmido de expresión pRRQ-1 de Y. lipolytica resultando la cepa P01-AS. La producción de dsRNA-OFR89 se determinó por RT-PCR y qRT-PCR. Con el fin de aumentar la producción de dsRNA-ORF89 en P01-AS, se realizaron diferentes pruebas de shock térmico, cambios de pH y concentraciones de sales en diferentes medios. Además, se mutagenizó el gen Rnt1 de Y. lipolytica. La actividad antiviral del dsRNA-ORF89 se evaluó mediante un bioensayo reto. Se obtuvo una producción de 182 ng de dsRNA-ORF89 por litro a las 32 horas de cultivo celular de la cepa de levadura P01-AS. La expresión del gen Rnt1 fue mayor en medio de cultivo YPD, y menor en medio mínimo YNB, sin embargo, su producción se correlaciona con la densidad celular, observando una mayor expresión en medios con agua de mar. Para la mutación del gen Rnt1 con el casete de interrupción URA::Rnt1, no se observó crecimiento conspicuo de colonias, lo que sugiere que la mutación es letal. El bioensayo reto en camarones inoculados con WSSV y tratados con ARN total proveniente de la cepa P01-AS produjo una mortalidad acumulada del 75%, menor a la del control sin tratamiento (100%). Los análisis in vitro de digestibilidad indicaron que las enzimas de la glándula digestiva de camarón digieren las células de Y. lipolytica e hidrolizan el dsRNA-ORF89 a partir de los 30 min. La construcción de la cepa de levadura P01-AS genera la posibilidad de tener un modelo alternativo para la producción de dsRNA específico en un sistema in vivo, sin embargo, es necesario mejorar las condiciones de producción de dsRNA específico en esta cepa.es_MX
dc.language.isoEspañoles_MX
dc.publisherCentro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.es_MX
dc.titleConstrucción de una cepa de levadura productora de dsRNA específico contra el virus de la mancha blanca en camarón Litopenaeus vannameies_MX
dc.typeTesises_MX
dc.documento.idalvarez_aes_MX
dc.documento.instCIBNORes_MX
dc.dirtesis.gradoDoctorado en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturaleses_MX
dc.dirtesis.disciplinaBiotecnologíaes_MX
dc.dirtesis.universidadCentro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.es_MX
dc.dirtesis.facultadPosgrado en Recursos Naturaleses_MX
dc.documento.fecha2017-03-14
dc.description.abstractenThe white spot syndrome virus (WSSV) is, until now, the most devastating disease for the cultivation of shrimp, causing mortalities of up to 100 % in a short period. A potential biotechnological tool against pathogenic viral is the RNA of interference (RNAi) mechanism that is induced by dsRNA. The in vitro production of the dsRNA is costly. An alternative is the dsRNA production in biological systems. The use of yeasts as Yarrowia lipolytica awards usable advantages for the production of the dsRNA. The objective of this study was to generate a strain of yeast producer of specific dsRNA against WSSV and to evaluate its antiviral activity in the shrimp Litopenaeus vannamei. The in vitro digestibility of the yeast Yarrowia lipolytica and of the specific dsRNA in the digestive tract of shrimp was essayed aiming to determine if the cell wall is degraded and to evaluate this yeast as carrier of dsRNA against WSSV. A construction of dsRNA-ORF89 in the plasmid pJC410 was sub cloned in the expression plasmid pRRQ-1 of Yarrowia lipolytica, resulting in the strain P01-AS. The production of dsRNA-ORF89 were determinate by RT-PCR y qRT-PCR. In order to increase the production of dsRNA-ORF89 in the strain P01-AS, were experimented with thermal shock, change in the pH and salt concentrations in different media. We also mutated the gene Rnt1 of Yarrowia lipolytica. The antiviral activity of dsRNA-ORF89 was tested in a challenge bioassay. A production of dsRNA-ORF89 of 182 ng was obtained by liter (8.9x10-6) after 32 hours of cellular cultivation of the yeast P01-AS strain. The expression of the RNAsa III was major in the medium YPD, and minor in the medium YNB. Nevertheless, its production is correlated to cellular density, observing a major expression in media containing seawater. For the mutation of the gene Rnt1, it was observed that in all the mutation events with the cassette of interruption URA::Rnt1, it did not observe conspicuous colonies growth suggesting that the mutation is lethal. The challenge bioassay in shrimp inoculated with WSSV and traded total RNA from strain P01-AS obtaining a cumulative mortality of 75 %, with regard to the control group without treatment (100 %). The digestibility tests in vitro found that enzymes from the digestive gland shrimp digest the cells of Y. lipolytica and hydrolyze dsRNA-ORF89 after 30 minutes. The construction of the strain of yeast P01-AS generates the possibility of having an alternative model for the production of specific dsRNA in a live system. Nevertheless, it is necessary to improve the production conditions of specific dsRNA in this strain.es_MX
dc.documento.subjectcamaron; digestibilidad; RNAi; WSSV; Yarrowia lipolyticaes_MX


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  • Tesis Digitales CIBNOR
    Esta colección contiene texto completo de las tesis de Maestría y Doctorado del Programa de Posgrado del CIBNOR.

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