Clonación molecular y caracterización de proteínas de membrana externa de Aeromonas veronii : su implicación en adhesión y su potencial como vacunas de adn para peces

Abstract

Las Aeromonas móviles (A. veronii, A. hydrophila y A. caviae) son de las bacterias más comunes en ambientes acuáticos en todo el mundo. Con mayor frecuencia se han identificado como el agente etiológico de la septicemia hemorrágica bacteriana y otras condiciones ulcerativas en peces cultivados. Por otra parte, estas bacterias han sido implicadas en gastroenteritis y una variedad de infecciones extraintestinales en humanos. Por lo tanto, además de impactar negativamente en la industria del cultivo de peces, representan un riesgo en salud humana. La vacunación se ha establecido como un método efectivo para la prevención de enfermedades infecciosas de peces cultivados; sin embargo, actualmente no existen vacunas disponibles contra las Aeromonas móviles. La habilidad de un patógeno para adherirse y subsecuentemente infectar un hospedero susceptible es un paso primordial en el desarrollo de la enfermedad. Por ende, aquellas moléculas de adhesión producidas por las bacterias patógenas son importantes factores de virulencia y candidatos apropiados para el desarrollo de vacunas. Con la finalidad de diseñar y construir una vacuna efectiva, segura y económica, contra las Aeromonas móviles, la presente tesis se enfocó en tres tareas: A) identificación de proteínas de superficie de A. veronii (adhesinas), implicadas en la adhesión a células epiteliales; B) clonación y caracterización molecular de los genes que codifican para dichas adhesinas y C) construcción de vacunas de ADN con los genes clonados como componentes antigénicos y evaluación de su potencial para la protección de peces contra infecciones por A. veronii. Los principales resultados se resumen en tres partes: 1) Omp38 y Omp48: potenciales adhesinas. Se identificaron dos proteínas de membrana externa (OMPs) de A. veronii de 38 y 48 kDa, que se denominaron Omp38 y Omp48, que mostraron afinidad por componentes de mucosas (mucina y lactoferrina) y por proteínas de la matriz extracelular (colágena y fibronectina). Esta propiedad está comúnmente asociada a adhesinas bacterianas. Anticuerpos policlonales contra Omp38 y Omp48 inhibieron significativamente la adhesión de A. veronii a células epiteliales in vitro, e inhibieron de manera cruzada, la adhesión de otras especies de Aeromonas y Vibrio. Además, Omp38 y Omp48 inhibieron competitivamente la adhesión de A. veronii. Estos resultados sugieren que ambas proteínas funcionan como factores de adhesión en A. veronii y que otras especies de Aeromonas y Vibrio poseen proteínas en su superficie con determinantes antigénicos conservados. 2) Clonación de los genes omp38 y omp48. Por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron fragmentos de los genes omp38 y omp48. Para clonar los genes completos se construyeron y tamizaron librerías genómicas y sub-genómicas de A. veronii. Sin embargo, debido a la posible toxicidad de los genes hacia la cepa de E. coli hospedera, éstos se tuvieron que clonar por medio de PCR inversa. Las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias nucleotídicas indican que Omp38 y Omp48 tienen características típicas de porinas bacterianas, incluyendo ausencia de cisteina, alto contenido de glicina, bajo contenido de prolina, punto isoeléctrico ácido y un péptido líder altamente hidrofóbico en su extremo N-terminal, con sitio de reconocimiento, [Ala-X-Ala], para la peptidasa señal I. Omp38 es similar a las porinas PhoE, OmpC y OmpF de bacterias entéricas y posee una estructura secundaria teórica constituida por 8 asas y 16 láminas β antiparalelas, con residuos conservados importantes para la estructura-función de las porinas. Omp48 es similar a la familia de porinas LamB y su modelo de conformación secundaria consiste de 9 asas y 18 láminas β antiparalelas. 3) Evaluación de las vacunas de ADN. Para la construcción de las vacunas de ADN, denominadas pOMP38P y pOMP48P, se subclonaron los genes omp38 y omp48 en el vector de expresión pcDNA3.1, bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus. Se evaluó su efecto protector contra infecciones experimentales por A. veronii en cabrilla arenera (Paralabrax maculatofasciatus), que es un recurso con potencial para la acuacultura regional. Como un ensayo preliminar, se analizó la expresión in vitro de Omp38 y Omp48 en células eucariotas a partir de pOMP38P y pOMP48P, la cual fue muy baja. Los peces vacunados intramuscularmente con las vacunas de ADN presentaron escasos, pero significativos niveles de anticuerpos anti-Omp38 y anti-Omp48 en suero, 4 y 6 semanas después de la vacunación, comparado con los peces vacunados con el plásmido pcDNA3.1 “vacío” o con solución de fosfatos. Los peces vacunados con pOMP38P, pOMP48P, o una mezcla de ambos, y retados con A. veronii, registraron un porcentaje relativo de supervivencia entre 50-60%. Los principales daños histológicos en bazo, hígado y riñón, que sufrieron los peces como consecuencia de la infección, se observaron en 40% de los peces inmunizados y en 80% en los peces control. Los resultados indican que la vacunación de cabrilla arenera con una sola dosis de vacunas de ADN que codifican para Omp38 u Omp48 no genera una respuesta humoral fuerte, pero confiere protección parcial contra infecciones experimentales con A. veronii. Con esta investigación se amplia el conocimiento sobre los mecanismos de adhesión de A. veronii y establece, por vez primera, el potencial de los genes que codifican para OMPs de bacterias Gram-negativas como componentes antigénicos de vacunas de ADN para el control de infecciones bacterianas de peces cultivados.