Evaluación del silenciamiento génico de la miostatina en el músculo aductor de nodipecten subnodosus

Abstract

La almeja mano de león Nodipecten subnodosus es un molusco pectínido de importancia comercial en el estado de Baja California Sur debido a su demanda y alto valor comercial ya que su mercado es principalmente para exportación. Esta especie se caracteriza por poseer un músculo aductor grande, de interés gastronómico por su sabor. Durante el crecimiento del músculo en vertebrados participan diferentes genes en su regulación; uno de estos es la MIOSTATINA, la cual es un potente regulador negativo de la masa muscular esquelética. El estudio de este gen ha interesado a diversos campos de la ciencia, desde ciencias pecuarias hasta ciencias médicas, lo cual ha resultado en que se ha estudiado en un gran número de especies de vertebrados. En el caso de invertebrados, particularmente pectínidos, el gen ortólogo de la miostatina (mstn) de vertebrados se ha caracterizado en Argopecten irradians, Chlamys farreri, Patinopecten yessoensis, A. purpuratus y recientemente en Nodipecten subnodosus. El silenciamiento génico a través del desencadenamiento del proceso de ARN de interferencia es una de las estrategias utilizadas para determinar la función de un gen. Recientemente en moluscos esta estrategia es utilizada para conocer la función de diferentes genes de interés para la acuacultura y genes involucrados en la inmunidad de los huéspedes intermediarios de la esquistosomiasis. Sin embargo, son pocos los estudios realizados en moluscos utilizando el ARN de interferencia y aún se encuentra en proceso el descubrimiento de todos los componentes de la maquinaria del silenciamiento génico en moluscos. En el presente trabajo se evaluó la doble cadena de ARN (dsRNA) para silenciar el ARN mensajero de la mstn. Se diseñó un experimento con una duración de 30 días para el silenciamiento del transcrito de la mstn a través de dsRNA, y en forma paralela evaluar la activación del mecanismo de interferencia por dsRNA usando el gen vital que codifica para la enzima GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapdh), además de utilizar un control negativo inyectando dsRNA de un gen no presente en el genoma de N. subnodosus el cual fue el gen mejorado de la proteína verde fluorescente (egfp, enhanced green fluorescent protein) para evaluar la introducción de dsRNA sin inducir efectos deletéreos o mortalidades. Se inyectó los días 0, 6 y 13 del experimento en el músculo aductor una de tres concentraciones de dsRNA del transcrito de la mstn (0, 5, y 30 µg) del transcrito de gapdh (0, 20 y 60 µg) o del transcrito de egfp (0, 20 y 60 µg), aplicando en todos los casos inmediatamente post-inyección impulsos eléctricos directamente sobre el músculo aductor. Se realizaron muestreos de organismos cinco veces durante el experimento (los días 3, 9, 15, 21 y 30). Se analizaron las variables biométricas (peso biomasa, peso músculo y peso gónada) de los organismos y las mortalidades que se presentaron a lo largo del experimento en los diferentes tratamientos, donde se observó un incremento en biomasa y peso de gónada y no se observó un incremento significativo en peso muscular, el cual se sugiere sea evaluado a futuro utilizando tiempos experimentales más largos. Se determinó la expresión relativa de la mstn y de gapdh por PCR cuantitativo usando oligonucleótidos externos a la dsRNA; los valores obtenidos fueron normalizados y se realizaron análisis de varianza de dos vías, encontrando diferencias significativas únicamente entre días experimentales, pero no se observaron diferencias significativas en expresión de la mstn o de gapdh entre las diferentes concentraciones evaluadas en cada caso. Debido a que se sabe que la expresión de la mstn en músculo aductor incrementa durante la gametogénesis en esta especie y que se observó un incremento en el peso gonadal durante el tiempo experimental, se realizó un análisis de covarianza buscando corregir por el posible impacto que la maduración gonádica pudiese haber tenido sobre la expresión de la mstn y gapdh, introduciendo como covariable el peso de la gónada de cada individuo cuya expresión relativa fue estimada. Al introducir el peso de la gónada como covariable en la expresión relativa de gapdh, indicó que esta era significante y al considerar ese crecimiento gonadal en el análisis se logró un ajuste de los valores de expresión. Se encontraron adicionalmente a las diferencias significativas entre días experimentales, diferencias significativas entre concentraciones del grupo control (0 µg dsRNA) y la expresión relativa de los grupos inyectados con la dsRNA (20 y 60 µg dsRNA-gapdh), con los dos últimos presentando una expresión significativamente menor que la del grupo control como sería esperado de una interferencia exitosa. En el caso de la mstn al introducir el peso de la gónada como covariable, se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones de la expresión relativa, donde los organismos inyectados solamente con solución salina (0 µg dsRNA) presentaron una expresión significativamente mayor que la expresión estimada para las concentraciones inyectadas de 5 y 30 µg dsRNA-mstn. En el caso de la dsRNA-egfp, se deberá reducir la dosis y/o evaluar otro gen como control negativo, ya que egfp causó efectos deletéreos en la dosis mayor. Adicionalmente se tomaron muestras de todo el músculo aductor durante los días 3 y 30 del experimento de dsRNA-mstn, para determinar si se presentó hipertrofia e hiperplasia entre los días experimentales. Se determinó el diámetro promedio de las fibras en cortes transversales del músculo aductor y se realizó un conteo total de fibras por el área total del músculo. Los análisis estadísticos para determinar si se presentó hipertrofia indicaron diferencias significativas entre días experimentales, indicando que no hubo hipertrofia ya que el tamaño de las fibras musculares al final del experimento (Md30) fue menor comparado con el del inicio del experimento (Md3). En el caso de la hiperplasia, los análisis estadísticos indican diferencias significativas entre días experimentales, observándose un incremento significativo en el número de fibras por mm2 entre el inicio y el final del experimento (Md3 a Md30), e indicando una posible hiperplasia. Así como en la variable de crecimiento de peso muscular no se observó un incremento de este tampoco se observó una hipertrofia resultado de la interferencia de la mstn, posiblemente debido a que se deben evaluar tiempos experimentales de mayor duración. Es importante realizar investigaciones futuras de este gen de importancia comercial con fines de clarificar su función en el desarrollo del músculo esquelético, así como su posible involucramiento en otras funciones, ya que es conocido que en pectínidos el gen de la miostatina se expresa en otros tejidos.