| dc.contributor.advisor | Ibarra Humphries, Ana María | |
| dc.contributor.author | Fuente Gómez, Mayra Guadalupe | |
| dc.date.issued | 2016 | es_MX |
| dc.identifier.uri | http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/521 | |
| dc.description.abstract | La almeja mano de león Nodipecten subnodosus es un molusco pectínido de importancia comercial en el estado de Baja California Sur debido a su demanda y alto valor comercial ya que su mercado es principalmente para exportación. Esta especie se caracteriza por poseer un músculo aductor grande, de interés gastronómico por su sabor. Durante el crecimiento del músculo en vertebrados participan diferentes genes en su regulación; uno de estos es la MIOSTATINA, la cual es un potente regulador negativo de la masa muscular esquelética. El estudio de este gen ha interesado a diversos campos de la ciencia, desde ciencias pecuarias hasta ciencias médicas, lo cual ha resultado en que se ha estudiado en un gran número de especies de vertebrados. En el caso de invertebrados, particularmente pectínidos, el gen ortólogo de la miostatina (mstn) de vertebrados se ha caracterizado en Argopecten irradians, Chlamys farreri, Patinopecten yessoensis, A. purpuratus y recientemente en Nodipecten subnodosus. El silenciamiento génico a través del desencadenamiento del proceso de ARN de interferencia es una de las estrategias utilizadas para determinar la función de un gen. Recientemente en moluscos esta estrategia es utilizada para conocer la función de diferentes genes de interés para la acuacultura y genes involucrados en la inmunidad de los huéspedes intermediarios de la esquistosomiasis. Sin embargo, son pocos los estudios realizados en moluscos utilizando el ARN de interferencia y aún se encuentra en proceso el descubrimiento de todos los componentes de la maquinaria del silenciamiento génico en moluscos. En el presente trabajo se evaluó la doble cadena de ARN (dsRNA) para silenciar el ARN mensajero de la mstn. Se diseñó un experimento con una duración de 30 días para el silenciamiento del transcrito de la mstn a través de dsRNA, y en forma paralela evaluar la activación del mecanismo de interferencia por dsRNA usando el gen vital que codifica para la enzima GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapdh), además de utilizar un control negativo inyectando dsRNA de un gen no presente en el genoma de N. subnodosus el cual fue el gen mejorado de la proteína verde fluorescente (egfp, enhanced green fluorescent protein) para evaluar la introducción de dsRNA sin inducir efectos deletéreos o mortalidades. Se inyectó los días 0, 6 y 13 del experimento en el músculo aductor una de tres concentraciones de dsRNA del transcrito de la mstn (0, 5, y 30 µg) del transcrito de gapdh (0, 20 y 60 µg) o del transcrito de egfp (0, 20 y 60 µg), aplicando en todos los casos inmediatamente post-inyección impulsos eléctricos directamente sobre el músculo aductor. Se realizaron muestreos de organismos cinco veces durante el experimento (los días 3, 9, 15, 21 y 30). Se analizaron las variables biométricas (peso biomasa, peso músculo y peso gónada) de los organismos y las mortalidades que se presentaron a lo largo del experimento en los diferentes tratamientos, donde se observó un incremento en biomasa y peso de gónada y no se observó un incremento significativo en peso muscular, el cual se sugiere sea evaluado a futuro utilizando tiempos experimentales más largos. Se determinó la expresión relativa de la mstn y de gapdh por PCR cuantitativo usando oligonucleótidos externos a la dsRNA; los valores obtenidos fueron normalizados y se realizaron análisis de varianza de dos vías, encontrando diferencias significativas únicamente entre días experimentales, pero no se observaron diferencias significativas en expresión de la mstn o de gapdh entre las diferentes concentraciones evaluadas en cada caso. Debido a que se sabe que la expresión de la mstn en músculo aductor incrementa durante la gametogénesis en esta especie y que se observó un incremento en el peso gonadal durante el tiempo experimental, se realizó un análisis de covarianza buscando corregir por el posible impacto que la maduración gonádica pudiese haber tenido sobre la expresión de la mstn y gapdh, introduciendo como covariable el peso de la gónada de cada individuo cuya expresión relativa fue estimada. Al introducir el peso de la gónada como covariable en la expresión relativa de gapdh, indicó que esta era significante y al considerar ese crecimiento gonadal en el análisis se logró un ajuste de los valores de expresión. Se encontraron adicionalmente a las diferencias significativas entre días experimentales, diferencias significativas entre concentraciones del grupo control (0 µg dsRNA) y la expresión relativa de los grupos inyectados con la dsRNA (20 y 60 µg dsRNA-gapdh), con los dos últimos presentando una expresión significativamente menor que la del grupo control como sería esperado de una interferencia exitosa. En el caso de la mstn al introducir el peso de la gónada como covariable, se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones de la expresión relativa, donde los organismos inyectados solamente con solución salina (0 µg dsRNA) presentaron una expresión significativamente mayor que la expresión estimada para las concentraciones inyectadas de 5 y 30 µg dsRNA-mstn. En el caso de la dsRNA-egfp, se deberá reducir la dosis y/o evaluar otro gen como control negativo, ya que egfp causó efectos deletéreos en la dosis mayor. Adicionalmente se tomaron muestras de todo el músculo aductor durante los días 3 y 30 del experimento de dsRNA-mstn, para determinar si se presentó hipertrofia e hiperplasia entre los días experimentales. Se determinó el diámetro promedio de las fibras en cortes transversales del músculo aductor y se realizó un conteo total de fibras por el área total del músculo. Los análisis estadísticos para determinar si se presentó hipertrofia indicaron diferencias significativas entre días experimentales, indicando que no hubo hipertrofia ya que el tamaño de las fibras musculares al final del experimento (Md30) fue menor comparado con el del inicio del experimento (Md3). En el caso de la hiperplasia, los análisis estadísticos indican diferencias significativas entre días experimentales, observándose un incremento significativo en el número de fibras por mm2 entre el inicio y el final del experimento (Md3 a Md30), e indicando una posible hiperplasia. Así como en la variable de crecimiento de peso muscular no se observó un incremento de este tampoco se observó una hipertrofia resultado de la interferencia de la mstn, posiblemente debido a que se deben evaluar tiempos experimentales de mayor duración. Es importante realizar investigaciones futuras de este gen de importancia comercial con fines de clarificar su función en el desarrollo del músculo esquelético, así como su posible involucramiento en otras funciones, ya que es conocido que en pectínidos el gen de la miostatina se expresa en otros tejidos. | es_MX |
| dc.language.iso | Español | es_MX |
| dc.publisher | Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. | es_MX |
| dc.title | Evaluación del silenciamiento génico de la miostatina en el músculo aductor de nodipecten subnodosus | es_MX |
| dc.type | Tesis | es_MX |
| dc.documento.id | fuente_m | es_MX |
| dc.documento.inst | CIBNOR | es_MX |
| dc.dirtesis.grado | Maestría en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales | es_MX |
| dc.dirtesis.disciplina | Acuicultura | es_MX |
| dc.dirtesis.universidad | Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. | es_MX |
| dc.dirtesis.facultad | Posgrado en Recursos Naturales | es_MX |
| dc.documento.fecha | 2016-07-07 | |
| dc.description.abstracten | The lion-paw scallop, Nodipecten subnodosus, is a mollusk of commercial importance in the state of Baja California Sur due to its high demand and commercial value. This species is characterized by having a large adductor muscle that is of gastronomic interest for its taste. Among vertebrates, skeletal muscle growth is regulated by several genes, one of which is myostatin (mstn). MSTN is known to be a potent negative regulator of skeletal muscle mass. This gene has been of interest in various fields of science, from animal science to medical science, which has resulted in a large number of vertebrate species being studied. In the case of invertebrates, particularly scallops, the mstn gene has been characterized in Argopecten irradians, Chlamys farreri, Patinopecten yessoensis, A. purpuratus and more recently in Nodipecten subnodosus. Gene silencing using RNA interference is widely used to study the function of a gene. Recently, in mollusks, this strategy has been used to determine the function of various genes of interest for aquaculture and genes involved in immunity of the intermediate hosts of schistosomiasis. However, there are few studies on mollusks using RNA interference and all components of the machinery of gene silencing in mollusks are still in the discovery process. In this work, a double-stranded RNA (dsRNA) was used to silence the mstn transcript. A 30 day experiment was designed, carrying in parallel an evaluation of the activation of the mechanism of interference by dsRNA using the vital gene gapdh encoding for the glyceraldehyde3-phophate dehydrogenase enzyme, GAPDH. The enhanced green fluorescent protein gene (egfp) was used as a negative control to evaluate the introduction of dsRNA that would not result in deleterious effects or mortality. On days 0, 6 and 13, three concentrations of dsRNA-mstn (0, 5, and 30 µg), dsRNA-gapdh (0, 20 and 60 µg), or dsRNA-egfp (0, 20 and 60 µg) were injected into the adductor muscle of individual scallops. In all cases, immediately after the injection, electrical impulses were applied directly to the adductor muscle. Sampling of organisms was performed five times during the experiment (days 3, 9, 15, 21 and 30). Biometric variables (biomass, muscle weight, gonad weight) were analyzed for all organisms and mortalities occurring throughout the experiment in the different treatments were recorded. An increase in biomass and gonad weight was observed along the experiment, but there was no significant increase in muscle weight. This suggests that the experimental time needs to be longer. The relative expression levels of mstn and gapdh were determined by quantitative PCR. The values obtained were normalized using the geometric mean of two reference genes and two-way analyses of variance were performed. Significant differences between experimental days were observed, but no significant differences in expression of mstn or gapdh between the different concentrations evaluated for each gene were observed. Because it was known that the expression of mstn in adductor muscle increases during gametogenesis in this species, an analysis of covariance was performed to correct for the possible impact that gonadal maturation might have had on the expression of mstn and gapdh. The gonad weight was introduced as the covariate for each individual whose relative expression was estimated. Introducing the gonad weight as a covariate in the relative expression of gapdh showed that this covariate was significant in the ANCOVA, and its inclusion in the analysis resulted in significant differences not only between experimental days, but between concentrations, with the control group (0 µg dsRNA) having a higher relative expression than that seen for the groups injected with the dsRNA (20 and 60 µg dsRNA-gapdh) as expected from a successful RNA interference. In the case of mstn, inclusion of gonad weight as a covariate in the analysis also resulted in a correction of the expression data finding significant differences between the control group (0 µg dsRNA) relative expression, which was significantly higher than the relative expression of both of the injected groups (concentrations of 5 and 30 µg dsRNA-mstn). For the case of egfp interference experiment, it was found that injection of dsRNA of this gene caused deleterious effects at the highest dosage evaluated indicating that in future studies another gene should be used as a negative control. Additionally, samples were taken from all adductor muscles from the dsRNA-mstn experiment on days 3 and 30 to determine whether there was hypertrophy and hyperplasia by the end of the experimental days. The mean diameter of fibers was obtained from adductor muscle cross-sections, and total counts of fibers held by the total muscle area were estimated. The ANOVA evaluating whether there was hypertrophy indicated significant differences between experimental days, although the results were unexpected because the size of the muscle fibers at the end of the experiment (MD30) was smaller compared to the beginning (Md3). In the case of hypertrophy, statistical analyses indicated significant differences between experimental days as well, but in this case showing an increase in the number of fibers per mm2 between the start and the end of the experiment (Md3 to MD30), and therefore suggesting that hyperplasia did occur. Nevertheless, further work with longer experimental periods would be necessary to clarify if hypertrophy and hyperplasia result from mstn RNA interference. It is also important to study the impact of the dsRNA interference on other tissues than muscle to further understand the function of this gene because it is known that myostatin in pectinids is expressed in multiple tissues. | es_MX |
| dc.documento.subject | silenciamiento génico; miostatina; músculo aductor; nodipecten subnodosus | es_MX |
