Neutralización de la toxinas PirA y PirB de Vibrio parahaemolyticus asociado a AHPND con fragmentos de anticuerpos desplegados en fagos

Abstract

En los últimos cinco años la producción de camarón a nivel mundial se ha visto afectada por la Enfermedad de Necrosis Hepatopancreática Aguda (AHPND, por sus siglas en ingles) que ha causado hasta el 100% de mortandad en los cultivos. Esta enfermedad ha sido asociada a cepas de Vibrio parahaemolyticus que poseen un plásmido llamado pVA1, el cual posee los genes pirA y pirB que codifican para las toxinas PirA y PirB, que son principal factor virulento en camarón que provoca la AHPND y que solo habían sido descritas en bacterias del género Photorhabdus. Por lo anterior, es necesario encontrar una manera eficiente y especifica de tratar la enfermedad. Una alternativa que ha demostrado ser viable para neutralizar patógenos y toxinas es el uso de anticuerpos recombinantes, ya que con las nuevas biotecnologías se pueden seleccionar fragmentos de anticuerpos específicos y altamente afines por el blanco; así como producirlos de manera rápida y eficiente. Por lo tanto el objetivo de este trabajo fue seleccionar y producir fragmentos de anticuerpos desplegados en fagos que reconozcan y neutralicen las toxinas PirA y PirB de una cepa de V. parahaemolyticus asociadas al AHPND. Con este fin, se realizó la transformación de la cepa de E. coli BL21 con el vector de clonación pET-28atoxA y pET-32atoxB para expresar y purificar las toxinas recombinantes PirA y PirB. Ambas sirvieron como blanco para seleccionar fragmentos de anticuerpos que se unen a la toxina mediante la técnica de despliegue en fagos. A partir de una biblioteca de anticuerpos humanos no inmune (8x1011 UFC/mL), desplegados en la superficie de fagos, se seleccionaron fagos-scFv anti-PirA y anti-PirB mediante dos rondas de bioselección. Para la toxina PirA se obtuvieron títulos de 2.26x104 UFC/mL y 5x104 UFC/mL para la primera y segunda ronda, respectivamente; mientras que para la toxina PirB se obtuvieron 3.33x104 UFC/mL y 6.2x105 UFC/mL, respectivamente. Todas las rondas fueron evaluadas por ELISA y los títulos y los valores de absorbancia indican un reconocimiento hacia PirA y PirB, así como un enriquecimiento de los anticuerpos más afines por estas toxinas. En los retos para evaluar la capacidad de neutralización de scFv de manera indirecta midiendo el porcentaje de mortalidad se encontró una la disminución en el porcentaje de mortalidad 25 por ciento a las 24 h y 56 por ciento las 48 h (p< 0.05) en el grupo tratado con los fagos-scFv anti PirA y anti PirB en grupo retado con el medio libre de células de V. parahaemolyticus con las toxinas. En conclusión, los anticuerpos desplegados en fagos reconocen y neutralizan específicamente a PirA y PirB, reduciendo la mortalidad en camarón con AHPND.