Clonación, secuenciación y mapeo cromosómico de las dos formas de la enzima superóxido dismutasa tipo cuZn (Cu,ZnSOD) de la levadura marina Debaryomyces hansenii

Abstract

La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima que comunmente se encuentra en los organismos aeróbicos, y juega una papel central en el metabolismo de los radicales libres y las especies reactivas de oxígeno. La levadura marina Debaryomyces hansenii cepa C11 presenta tres isoformas de la enzima cobre-zinc SOD (dos homodímeros y un heterodímero). En un estudio previo, Hernández-Saavedra clonó la secuencia codificante de una de las dos formas básicas de la Cu,ZnSOD (SODC), denominada dh sod1. En el presente trabajo se clono y secuencio la dh sod2 de la levadura marina D. hansenii. Se realizó un screening en una librería genómica para buscar la región promotora y se mapearon ambas formas dh sod1 y dh sod2 utilizando ADN intacto para separar los cromosomas mediante electroforésis de campo pulsante. El uso de primers degenerados, diseñados a partir de péptidos internos obtenidos mediante digestión con tripsina de la proteína purificada, permitió obtener fragmentos de ~420 pares de bases (pb) después de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El análisis de la secuencia mostró un 97% de homología con la SODC de S. cerevisiae y sólo un 69% de homología con la dh sod1 de D. hansenii. Un resultado similar fue obtenido al construir un árbol de homología con secuencias de levaduras marinas y terrestres reportadas en el Centro Nacional de Información en Biotecnología (NCBI). Se obtuvieron dos grandes grupos, uno que incluye levaduras terrestres y otro que incluye levaduras marinas. Sin embargo en el árbol de homología, la dh sod2 se incluyo en el grupo de las levaduras terrestres. Del screening de la librería genómica se obtuvieron varias clonas positivas, dos de las cuales fueron secuenciadas (una de 656 pb y otra de 660 pb), una de ellas con homología a secuencias del cromosoma VII de S. cerevisiae, sin embargo, no fue posible obtener la secuencia correspondiente a la dh sod del promotor. Se logró separar el ADN intacto de D. hansenii mediante electroforésis de campo pulsante, obteniendo un patrón difuso de pequeños cromosomas. Sin embargo, cuando se uso con la dh sod2 marcada con digoxigenina en la hibridación, se logró obtener una banda bien definida. Esto, aunado a los reportes de expresión diferencial de ambas formas (Dh SODC1 y Dh SODC2) bajo condiciones de estrés dado por compuestos clorados o metales sugieren el probable origen génico (no formas alélicas). La presencia y función de ambos genes en la levadura marina D. hansenii son probablemente el resultado de la adaptación a ambientes marinos y terrestres.