Caracterización de las secuencias ribosomales 16s (ADNr) de cianobacterias asociadas a eventos de toxicidad

Abstract

La proliferación de cianobacterias en reservorios de agua es un fenómeno muy común que representa un peligro potencial para el medio, para los organismos que lo habitan e incluso para el humano, debido a que la mayoría de estos afloramientos son tóxicos. Se han utilizado muchas técnicas para la identificación oportuna de especies de cianobacterias tóxicas, sin embargo, la mayoría resultan costosas, prolongadas y poco confiables. El objetivo de este trabajo fue caracterizar parcialmente la subunidad ribosomal 16s (ADNr) de cianobacterias para determinar su utilidad en la discriminación de especies y cepas tóxicas, por medio de sus fragmentos variables. Se utilizaron cultivos de cianobacterias provenientes de cepas comerciales de la Universidad de Texas y de aislamientos silvestres de México, asociados a intoxicación y muerte de varios animales silvestres y cultivados, e incluso irritación en humanos. Se probaron varios métodos de disrupción celular y extracción de ADN genómico (ADNg). Para la obtención de los fragmentos de ADNr se utilizó el protocolo reportado por Nübel y colaboradores en 1997, en el cual se amplifica ADNg mediante PCR con iniciadores específicos para la subunidad 16s de cianobacterias. Se obtuvieron 19 secuencias, 11 de las cuales provenían de cepas comerciales y 8 de aislamientos silvestres. El análisis BLAST demostró porcentajes de homologías del 92 al 99% de las secuencias con las especies más cercanas, así como las proporciones de identidad y coincidencias, corroborando las especies de referencia (cepas de la UTEX) e identificando las especies silvestres. Mediante el paquete DNAMAN® se obtuvo la secuencia consenso, el alineamiento y un dendograma de homologías de todas las secuencias, donde se observan fragmentos variables y conservados, confirmando que existen segmentos útiles para la discriminación de géneros, especies e incluso cepas. Mediante análisis de homología, las especies filamentosas se asociaron en 4 grupos diferentes, correspondientes a los géneros Schizothrix, Anabaena, Nodularia y Geitlerinema. La única especie unicelular (Synechococcus) se encontró aislada de los demás grupos, compartiendo un 86% de homología. El género Schizothrix no había sido reportado en el GenBank, por lo que las secuencias obtenidas son las primeras, debido a que se cuenta con 2 cepas de referencia de la UTEX y una cepa de origen silvestre, reportada como tóxica en la localidad de muestreo. Dentro del género Anabaena se identificaron 2 especies diferentes, A. flos-aquae y A. variabilis, reafirmando la utilidad de las herramientas moleculares para discriminar no sólo géneros, sino también especies de cianobacterias. Cabe mencionar que 3 cultivos de origen silvestre, asociados a eventos tóxicos (A. Variabilis CIBNOR 23, Synechococcus sp CIBNOR 42 y Geitlerinema sp CIBNOR 29) que no habían sido identificados correctamente con técnicas clásicas (microscopía y morfometría), presentaron diversos fragmentos variables al confrontarlas cada una con sus homólogas de referencia, por lo que se concluye que con esta técnica es posible identificar especies de una manera más confiable e incluso diferenciar cepas dentro de una misma especie. Finalmente se concluye que este trabajo marca la pauta para establecer planes de monitoreo de especies de cianobacterias tóxicas en reservorios de agua, de una manera más confiable y rápida con la posible creación en el futuro de sondas genéticas especie-específicas y mapas biogeográficos de dichas especies.