La catepsina D1 de la langosta americana, Homarus americanus: estudio de activación termodinámica, estabilidad y especificidad

Abstract

Las enzimas adaptadas al frío son sintetizadas por los organismos ectotermos que habitan ambientes de baja temperatura para asegurar su desempeño fisiológico. Estas enzimas son de gran interés biotecnológico debido a que poseen mayor eficiencia catalítica y menor estabilidad térmica que sus homólogos de organismos adaptados a temperaturas superiores; se ha sugerido que una mayor flexibilidad estructural es responsable de dichas características. La langosta americana (Homarus americanus) es un organismo ectotermo cuyo hábitat marino varía en temperatura en el rango de 0-25 °C, y por lo tanto la síntesis de peptidasas digestivas adaptadas al frío es indispensable para asegurar un nivel suficiente de proteólisis digestiva. La proteólisis digestiva en la langosta americana se basa en peptidasas de las clases aspártico y cisteíno. En estudios anteriores se ha demostrado que la aspártico peptidasa catepsina D1 del jugo gástrico de la langosta americana, en comparación con la catepsina D bovina, posee mayor eficiencia catalítica en el rango de 4-25 °C. En este trabajo se investigó si la catepsina D1 es una enzima adaptada al frío con base en estudios de activación termodinámica, estabilidad y especificidad por sustrato de la enzima purificada del jugo gástrico. Con fines comparativos se incluyeron homólogos de organismos endotermos, la catepsina D bovina y la pepsina gástrica porcina. La tasa de recambio (kcat) de la catepsina D1 es mayor que la de sus homólogos de bovino y de porcino en el rango de 5 a 55 °C. La mayor eficiencia catalítica de la catepsina D1 de la langosta también se manifestó en una menor energía de activación del complejo enzima-sustrato (G#). El G# se optimiza con el decremento de la entalpía de activación (H#) y/o el aumento de la entropía de activación (S#), dado que G#= H#-TS#. Al igual que otras enzimas adaptadas al frío, la catepsina D1 optimiza el valor de H# a expensas de un valor de S# desfavorable. Así, el H# es la principal característica de las enzimas adaptadas al frío, lo que permite reducir la dependencia a la temperatura de la velocidad de reacción. Se puede especular que el efecto antagónico de S# podría deberse a un incremento en la flexibilidad, de tal manera que el estado basal del complejo enzima-sustrato ocupa una distribución más amplia de estados conformacionales, lo que se traduce en una mayor entropía de este estado en comparación con los homólogos de organismos endotermos. La estabilidad térmica de las enzimas se analizó por fluorometría en ausencia/presencia de pepstatina A, un inhibidor análogo al estado de transición de sustrato. La catepsina D1 se desnaturalizó a menor temperatura que sus contrapartes y la interacción con pepstatina A tiene mayor efecto estabilizante en catepsina D1, este resultado sustenta la hipótesis de la mayor flexibilidad de la catepsina D1. La especificidad se analizó usando una colección de 124 tetradecapéptidos diseñada de tal manera que presenta un total de 1612 posibles sitios de hidrólisis diferentes, los sitios de hidrólisis se identificaron por LC-MS/MS. La catepsina D1 conserva la especificidad de sus homólogos de bovino y de porcino, hidroliza enlaces peptídicos con residuos hidrofóbicos en P1 y P1’ (Phe, Trp, Tyr, Met, Leu) y es una endopeptidasa. El análisis de secuencias mostró que la catepsina D1 conserva en general la estructura terciaria de las peptidasas aspárticas tipo pepsina, así también conserva los residuos involucrados en los subsitios de interacción con el sustrato, pero presenta diferencias en el contenido de residuos de prolina y glicina. Las características de la catepsina D1 de la langosta americana sustentan que es una enzima adaptada al frío.