Genotipificación de Perkinsus marinus e Inmunogenómica de Crassostrea corteziensis infectado con P. marinus aislado del noroeste de México

Abstract

La prevalencia del protozoario Perkinsus marinus fue evaluada en branquias del ostión de placer Crassostrea cortezienisis de dos esteros de Nayarit, México. El protozoario fue identificado mediante la amplificación por PCR de la región de espaciadores inter transcritos (ITS) del ADNr de Perkinsus spp. El patógeno fue encontrado en 92% de los ostiones de Boca de Camichín y 77% de los ostiones de Pozo Chino. Las secuencias ITS presentaron del 96–100% de similitud con P. marinus. La secuencia ITS mas frecuente (JQ266236) presentó 100% de identidad con el locus ITS de P. marinus de Nueva Jersey, Maryland, Carolina del Sur y Texas, y la segunda secuencia mas frecuente (JQ266240) mostró 100% de identidad con el ITS de P. marinus de Nueva Jersey, Carolina del Sur, Louisiana y Bahía Kino, Sonora, México. Las 14 secuencias de la región de espaciadores no transcritos (NTS) presentaron 98% de similitud con P. marinus de Texas. El polimorfismo mas frecuente se identificó en la posición nucleotídica 446 de la región ITS, sin embargo, el NTS fue la región mas polimórfica, sugiriendo que esta región es adecuada para identificación de genotipos, y la región mas conservada que fue el ITS es mejor para diagnóstico específico. Las secuencias ITS y NTS de P. marinus obtenidas de C. corteziensis fueron agrupadas en dos clados, identificando dos variantes alélicas de P. marinus. Mediante la amplificación por PCR de la región ITS de P. marinus, se identificó el protozoario en ostiones C. cortezienisis de Baja California Sur, México (KJ458987) que presentó 100% de identidad con P. marinus de Nayarit, México (JQ266240). La prevalencia en ostiones de BCS fue de 100% con intensidades 1–2, que fue mayor a ostiones de Nayarit (83.34%) con intensidades de 0–5. La intensidad de P. marinus en C. corteziensis aumentó de 1–2 a 2–5 con el incremento de la temperatura en condiciones experimentales. P. marinus causó 43.6% de mortalidad en ostiones inyectados con P. marinus, demostrando que C. corteziensis es susceptible a alta a altas dosis de P. marinus. Diferentes niveles de infección se registraron en ostiones inyectados con P. marinus a pesar de estar cohabitando. A partir de los 3 arreglos de ostiones con dos condiciones de infección natural por P. marinus procedentes de Nayarit y BCS, y de ostiones infectados experimentalmente, se obtuvieron 166 genes candidatos para ser genes de referencia. Se obtuvo que los genes RPL10, GAPDH, RPL10 fueron los mas estables, y el gen ACT–β fue el mas inestable. Los mecanismos de respuesta inmune identificados para C. corteziensis con bajas infecciones fueron: Receptores Toll, factor nuclear NF–κβ, autofagia, apoptosis y estrés oxidativo, y para ostiones con altas infecciones se identificaron genes de los procesos de inhibición de apoptosis y regulación negativa de apoptosis, y genes involucrados en la activación del factor nuclear NF–κβ. Genes involucrados en fagocitosis se presentaron en todas las condiciones de infección. Ostiones con bajas infecciones de P. marinus presentaron mayores niveles de expresión relativa respecto a ostiones con altas infecciones del inhibidor de serine proteasas, Duox o NADPH–oxidasa y ACT–β involucrados en la fagocitosis, el antioxidante SOD y GST, LPTNF y ECSIT que participan en la traslocación del factor NF–κβ activando genes de respuesta inmune, caspasas CAS8, inhibidores de apoptosis B–IAP y B–IAP2 y el fragmentador de ADN que participan en la apotosis. Peroxidasin, caspasa 3 e NF-K-Inh no presentaron diferencias entre condiciones de infección. Mediante secuenciación RNA–Seq Illumina 2000, se obtuvieron 133,814,590 lecturas de 100 pb, y del ensamblaje del transcriptoma de C. corteziensis realizado con CLC se obtuvieron 105,000 contigs con una longitud N50 de 918 pb. En este estudio se generó una aproximación transcriptomica de C. corteziensis, contribuyendo al conocimiento genómico de la especie, y a la identificación de genes en respuesta ante P. marinus. Se considera que el conjunto de la alta expresión relativa de inhibidores de serine proteasas, activación de los procesos de inflamación y apoptosis, contrarrestan la proliferación de P. marinus en C. corteziensis. La información generada permitirá profundizar en genes específicos que confieren resistencia ante patógenos.