PROTEINASAS ASPÁRTICAS DIGESTIVAS DE LAS LANGOSTAS QUELADAS Homarus gammarus Y Homarus americanus: CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR

Abstract

De manera general se acepta que las serino proteinasas son las principales participantes en la digestión del alimento en los crustáceos, sin embargo en este trabajo se encontró que los componentes proteinolíticos del jugo gástrico de las langostas ame rica na (Homarus americanus) y europea (Homarus gammorus) son cisteíno y aspártico proteinasas exclusivamente. El presente es el primer trabajo en donde se caracteriza bioquímica y molecularmente a una aspártico proteasa participante de la digestión extracelular en crustáceos. En las langostas queladas, el mRNA de esta aspártico proteinasa se expresa exclusivamente en el tejido de la glándula digestiva y la forma activa se encuentra en el jugo gástrico de donde se aisló usando cromatografía de afinidad. En una SDS-PAGE bajo condiciones reductoras la enzima purificada revela una sola banda de "50 kDa. Se confirmó la identidad de esta enzima como catepsina 0 por medio de la secuenciación N-terminal, por espectrometría de masas y del cDNA que la codifica. Se comprobó su función digestiva, pues además de la expresión tejido-especifica, se confirmo, por medio de un análisis de qPCR, que la concentración del mRNA de esta enzima varía a lo largo de un periodo de ayuno y reatimentaci~n. Las propiedades catalíticas de las enzimas aisladas de langostas fueron comparadas con las de la catepsina D bovina y se demostró que son diferentes en muchos aspectos. Las enzimas de las langostas tienen actividad proteinolítica a un rango de pH más amplio comparado con su homólogo bovino tanto para sustratos naturales como sintéticos. También se evaluó la dependencia a la temperatura de los parárnetros cinéticos KM, Vmax y kcat, las enzimas de las langostas no mostraron una diferencia significativa en los valores de KM a las tres temperaturas evaluadas (4, 10 y 25 "C), mientras que la enzima bovina tiene valores de KM dependientes de la temperatura. El valor del kcaJK~ de las langostas resultó ser cerca de 20 veces mayor para las langostas que para la enzima bovina. En el presente trabajo se propone que las propiedades catalíticas de las catepsinas D de las langostas pueden ser el resultado de un aumento en la flexibilidad de su conformación estructural, pues en una modelación por comparación, se encontró que la diferencia más conspicua entre las enzimas de las langostas y la bovina es la sustitución de residuos de prolina en un sitio putativo de unión al sustrato conocido como "polyproline loop", lo que hipotéticamente podría permitir un centro catalítico más flexible que conlleva a una mayor eficiencia catalítica, la cual es intercambiada por una baja estabilidad a altas temperaturas, ambas propiedades son concurrentes en enzimas de organismos adaptados a ambientes fríos.