PROTEINASAS ASPÁRTICAS DIGESTIVAS DE LAS LANGOSTAS QUELADAS Homarus gammarus Y Homarus americanus: CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
Resumen
De manera general se acepta que las serino proteinasas son las principales
participantes en la digestión del alimento en los crustáceos, sin embargo en este
trabajo se encontró que los componentes proteinolíticos del jugo gástrico de las
langostas ame rica na (Homarus americanus) y europea (Homarus gammorus) son
cisteíno y aspártico proteinasas exclusivamente. El presente es el primer trabajo en
donde se caracteriza bioquímica y molecularmente a una aspártico proteasa
participante de la digestión extracelular en crustáceos. En las langostas queladas, el
mRNA de esta aspártico proteinasa se expresa exclusivamente en el tejido de la
glándula digestiva y la forma activa se encuentra en el jugo gástrico de donde se aisló
usando cromatografía de afinidad. En una SDS-PAGE bajo condiciones reductoras la
enzima purificada revela una sola banda de "50 kDa. Se confirmó la identidad de esta
enzima como catepsina 0 por medio de la secuenciación N-terminal, por
espectrometría de masas y del cDNA que la codifica. Se comprobó su función digestiva,
pues además de la expresión tejido-especifica, se confirmo, por medio de un análisis de
qPCR, que la concentración del mRNA de esta enzima varía a lo largo de un periodo de
ayuno y reatimentaci~n. Las propiedades catalíticas de las enzimas aisladas de
langostas fueron comparadas con las de la catepsina D bovina y se demostró que son
diferentes en muchos aspectos. Las enzimas de las langostas tienen actividad
proteinolítica a un rango de pH más amplio comparado con su homólogo bovino tanto
para sustratos naturales como sintéticos. También se evaluó la dependencia a la
temperatura de los parárnetros cinéticos KM, Vmax y kcat, las enzimas de las langostas no
mostraron una diferencia significativa en los valores de KM a las tres temperaturas
evaluadas (4, 10 y 25 "C), mientras que la enzima bovina tiene valores de KM
dependientes de la temperatura. El valor del kcaJK~ de las langostas resultó ser cerca
de 20 veces mayor para las langostas que para la enzima bovina. En el presente trabajo
se propone que las propiedades catalíticas de las catepsinas D de las langostas pueden
ser el resultado de un aumento en la flexibilidad de su conformación estructural, pues
en una modelación por comparación, se encontró que la diferencia más conspicua
entre las enzimas de las langostas y la bovina es la sustitución de residuos de prolina en
un sitio putativo de unión al sustrato conocido como "polyproline loop", lo que
hipotéticamente podría permitir un centro catalítico más flexible que conlleva a una
mayor eficiencia catalítica, la cual es intercambiada por una baja estabilidad a altas
temperaturas, ambas propiedades son concurrentes en enzimas de organismos
adaptados a ambientes fríos.