Genómica de la espermatogénesis en la Almeja Mano de León Nodipecten subnodosus

Abstract

A pesar de los grandes avances en las tecnologías de secuenciación, la información genómica disponible para especies marinas no-modelo de interés ecológico, evolutivo y económico es aún escasa. El objetivo de este trabajo fue identificar genes expresados durante la espermatogénesis en la almeja hermafrodita funcional Nodipecten subnodosus (Mollusca: Bivalvia: Pectinidae), con el propósito de obtener un panel de genes que pudieran a futuro permitir el estudio de transcripción diferencial de genes entre almejas diploides y triploides en el contexto del arresto meiótico y esterilidad reproductiva. Dado que la principal meta era aislar genes involucrados en meiosis y otros procesos relacionados a la maduración testicular, se generaron genotecas de hibridación sustractiva de testículo vs gónada inactiva. Dos aproximaciones de secuenciación fueron empleadas, obteniéndose 325 y 177 ESTs mediante secuenciación capilar (Sanger) y mediante el uso de pirosecuenciación (454-FLX) se maximizó la cantidad de ESTs resultando en 34,276 lecturas. Un total de 1,153 genes de la genoteca de testículo tuvieron un hit por blastx y una anotación ontológica, incluyendo genes de meiosis, espermatogénesis, diferenciación sexual y elementos transponibles. Algunos de los genes de meiosis identificados poseen función en el apareamiento de cromosomas (scp2, scp3), recombinación y reparación de ADN (dmc1, rad51, ccnb1ip1/hei10) y en checkpoints de meiosis (rad1, hormad1, dtl/cdt2). Los análisis de expresión para genes de meiosis en distintos estadios gametogénicos en ambas regiones sexuales de la gónada confirmaron que la expresión fue específica o incrementada hacia el testículo en maduración. Los genes de espermatogénesis incluyeron algunos reconocidos como testis-específicos (kelch-10, shippo1, adad1), y algunos de ellos se conoce que están relacionados a esterilidad. Los genes de diferenciación sexual incluyen a uno de los genes mas conservados en el comienzo de la cascada de determinación sexual (dmrt1). La identificación de transcritos codificantes para elementos transponibles, transcriptasas reversas, y transposasas de la genoteca de testículo en maduración son evidencia de que la transposición es un evento activo durante la espermatogénesis en N. subnodosus. En relación a la genoteca de gónada inactiva, se identificaron 833 transcritos con anotación funcional relacionada a la maquinaria de transcripción y traducción de proteínas, y más importante, al mantenimiento y control de la línea germinal (notch homolog 2, btg member 2, btf3 homolog 4, hes-1, Tcf21). El segundo objetivo fue establecer la major estrategia para analizar la expresión por PCR cuantitativa, definiendo el impacto de la elección al azar de genes de referencia en la normalización de la expresión génica y las inferencias derivadas de esto. Para especies nomodelo, con información mínima o inexistente, la cuantificación relativa de la expresión génica requiere de información preliminar que incluya el aislamiento de genes de referencia potenciales y la identificación de aquellos que se expresan establemente bajo las condiciones biológicas de interés. En éste trabajo, secuencias parciales de cuatro genes fueron aisladas de ADNc de tejido gonadal de N. subnodosus para ser evaluados como genes de referencia: 18S-rRNA (18S), riboproteina l8 (rp-l8), actina-β (act-β), y el factor de elongación 1α (ef-1α), con una quinta secuencia codificante para una alfa-tubulina (tub-α) encontrada en las genotecas SSH que también se agregó como un gen potencial de referencia. Los análisis de estabilidad de estos cinco genes usando geNorm y NormFinder indicaron que 18S junto con rp-l8 fueron los genes más estables para la normalización de expresión génica durante el desarrollo gonadal en ambas partes sexuales. El gen menos estable fue tub-α, que mostró una expresión sesgada entre regiones sexuales de la gónada, por lo que fue analizado como un gen blanco. La expresión relativa, estimada mediante la normalización con la combinación de 18S y rp-l8 como genes de referencia, indicaron que en el avance de el desarrollo gonadal, el gen tub-α fue sobreexpresado en la región masculina, indicando que se trata de una isoforma testículo-específica. Análisis posteriores de su expresión en distintos tejidos indicaron que tub-α es expresado en forma elevada y específicamente en gónada masculina, aunque la expresión en tejido de músculo aductor fue también observada pero en niveles significativamente menores que en la región testicular. Las tubulinas han sido extensivamente usadas como genes de referencia, pero en este trabajo se ha demostrado que algunas tubulinas pueden no ser adecuadas como genes de referencia. Otro gen aislado de forma dirigida, un miembro de la familia de las DEADbox ARN helicasas (ddx) no mostró cambios en su expresión durante el desarrollo de la gónada o entre regiones sexuales, y fue empleado para analizar su expresión y discutir las distintas inferencias estadísticas que resultan de el uso arbitrario de genes ‘elegidos al azar’ durante la normalización de la expresión génica.