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dc.contributor.advisorIbarra Humphries, Ana Maríaes_MX
dc.contributor.advisorGarcía Gasca, Silvia Alejandraes_MX
dc.contributor.authorLlera Herrera, Raúl Antonioes_MX
dc.date.issued2013es_MX
dc.identifier.urihttp://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/364
dc.description.abstractA pesar de los grandes avances en las tecnologías de secuenciación, la información genómica disponible para especies marinas no-modelo de interés ecológico, evolutivo y económico es aún escasa. El objetivo de este trabajo fue identificar genes expresados durante la espermatogénesis en la almeja hermafrodita funcional Nodipecten subnodosus (Mollusca: Bivalvia: Pectinidae), con el propósito de obtener un panel de genes que pudieran a futuro permitir el estudio de transcripción diferencial de genes entre almejas diploides y triploides en el contexto del arresto meiótico y esterilidad reproductiva. Dado que la principal meta era aislar genes involucrados en meiosis y otros procesos relacionados a la maduración testicular, se generaron genotecas de hibridación sustractiva de testículo vs gónada inactiva. Dos aproximaciones de secuenciación fueron empleadas, obteniéndose 325 y 177 ESTs mediante secuenciación capilar (Sanger) y mediante el uso de pirosecuenciación (454-FLX) se maximizó la cantidad de ESTs resultando en 34,276 lecturas. Un total de 1,153 genes de la genoteca de testículo tuvieron un hit por blastx y una anotación ontológica, incluyendo genes de meiosis, espermatogénesis, diferenciación sexual y elementos transponibles. Algunos de los genes de meiosis identificados poseen función en el apareamiento de cromosomas (scp2, scp3), recombinación y reparación de ADN (dmc1, rad51, ccnb1ip1/hei10) y en checkpoints de meiosis (rad1, hormad1, dtl/cdt2). Los análisis de expresión para genes de meiosis en distintos estadios gametogénicos en ambas regiones sexuales de la gónada confirmaron que la expresión fue específica o incrementada hacia el testículo en maduración. Los genes de espermatogénesis incluyeron algunos reconocidos como testis-específicos (kelch-10, shippo1, adad1), y algunos de ellos se conoce que están relacionados a esterilidad. Los genes de diferenciación sexual incluyen a uno de los genes mas conservados en el comienzo de la cascada de determinación sexual (dmrt1). La identificación de transcritos codificantes para elementos transponibles, transcriptasas reversas, y transposasas de la genoteca de testículo en maduración son evidencia de que la transposición es un evento activo durante la espermatogénesis en N. subnodosus. En relación a la genoteca de gónada inactiva, se identificaron 833 transcritos con anotación funcional relacionada a la maquinaria de transcripción y traducción de proteínas, y más importante, al mantenimiento y control de la línea germinal (notch homolog 2, btg member 2, btf3 homolog 4, hes-1, Tcf21). El segundo objetivo fue establecer la major estrategia para analizar la expresión por PCR cuantitativa, definiendo el impacto de la elección al azar de genes de referencia en la normalización de la expresión génica y las inferencias derivadas de esto. Para especies nomodelo, con información mínima o inexistente, la cuantificación relativa de la expresión génica requiere de información preliminar que incluya el aislamiento de genes de referencia potenciales y la identificación de aquellos que se expresan establemente bajo las condiciones biológicas de interés. En éste trabajo, secuencias parciales de cuatro genes fueron aisladas de ADNc de tejido gonadal de N. subnodosus para ser evaluados como genes de referencia: 18S-rRNA (18S), riboproteina l8 (rp-l8), actina-β (act-β), y el factor de elongación 1α (ef-1α), con una quinta secuencia codificante para una alfa-tubulina (tub-α) encontrada en las genotecas SSH que también se agregó como un gen potencial de referencia. Los análisis de estabilidad de estos cinco genes usando geNorm y NormFinder indicaron que 18S junto con rp-l8 fueron los genes más estables para la normalización de expresión génica durante el desarrollo gonadal en ambas partes sexuales. El gen menos estable fue tub-α, que mostró una expresión sesgada entre regiones sexuales de la gónada, por lo que fue analizado como un gen blanco. La expresión relativa, estimada mediante la normalización con la combinación de 18S y rp-l8 como genes de referencia, indicaron que en el avance de el desarrollo gonadal, el gen tub-α fue sobreexpresado en la región masculina, indicando que se trata de una isoforma testículo-específica. Análisis posteriores de su expresión en distintos tejidos indicaron que tub-α es expresado en forma elevada y específicamente en gónada masculina, aunque la expresión en tejido de músculo aductor fue también observada pero en niveles significativamente menores que en la región testicular. Las tubulinas han sido extensivamente usadas como genes de referencia, pero en este trabajo se ha demostrado que algunas tubulinas pueden no ser adecuadas como genes de referencia. Otro gen aislado de forma dirigida, un miembro de la familia de las DEADbox ARN helicasas (ddx) no mostró cambios en su expresión durante el desarrollo de la gónada o entre regiones sexuales, y fue empleado para analizar su expresión y discutir las distintas inferencias estadísticas que resultan de el uso arbitrario de genes ‘elegidos al azar’ durante la normalización de la expresión génica.es_MX
dc.language.isoeses_MX
dc.publisherCentro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.es_MX
dc.titleGenómica de la espermatogénesis en la Almeja Mano de León Nodipecten subnodosuses_MX
dc.documento.idcibnor.2013.llera_res_MX
dc.documento.indicellera_res_MX
dc.documento.instcibnores_MX
dc.dirtesis.gradoDoctorado en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturaleses_MX
dc.dirtesis.disciplinaAcuiculturaes_MX
dc.dirtesis.universidadCentro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.es_MX
dc.dirtesis.facultadPosgrado en Recursos Naturaleses_MX
dc.documento.fechaJulio, 2013es_MX
dc.description.abstractenDespite the great advances in sequencing technologies, genomic and transcriptomic information for marine non-model species with ecological, evolutionary, and economical interest is still scarce. This work was aimed to identify genes expressed during spermatogenesis in the functional hermaphrodite scallop Nodipecten subnodosus (Mollusca: Bivalvia: Pectinidae), with the purpose of obtaining a panel of genes that would allow in the future for the study of differentially transcribed genes between diploid and triploid scallops in the context of meiotic arrest and reproductive sterility. Because the principal aim was to isolate genes involved in meiosis and other testis maturation-related processes, suppressive subtractive hybridization libraries of testis vs. inactive gonad were generated. Two sequencing approaches were used, obtaining 352 and 177 ESTs by Sanger sequencing, and by using pyrosequencing (454-Roche) we maximized the identified ESTs to 34,276 reads. A total of 1,153 genes from the testis library had a blastx hit and GO annotation, including genes specific for meiosis, spermatogenesis, sex-differentiation, and transposable elements. Some of the identified meiosis genes function in chromosome pairing (scp2, scp3), recombination and DNA repair (dmc1, rad51, ccnb1ip1/hei10), and meiotic checkpoints (rad1, hormad1, dtl/cdt2). Gene expression analyses in different gametogenic stages in both sexual regions of the gonad of meiosis genes confirmed that the expression was specific or increased towards the maturing testis. Spermatogenesis genes included known testis-specific ones (kelch-10, shippo1, adad1), with some of these known to be associated to sterility. Sex differentiation genes included one of the most conserved genes at the bottom of the sex-determination cascade (dmrt1). Transcript from transposable elements, reverse transcriptase, and transposases in this library evidenced that transposition is an active process during spermatogenesis in N. subnodosus. In relation to the inactive library, we identified 833 transcripts with functional annotation related to activation of the transcription and translation machinery, but more importantly, to germline control and maintenance (notch homolog 2, btg member 2, btf3 homolog 4, hes-1, Tcf21).. The second goal of this work was to establish the best strategy for analyzing gene expression by quantitative PCR, defining the impact that reference genes randomly chosen have on normalization of gene expression and the inferences derived from that. For nonmodel species as many used for aquaculture, with minimal or no genomic information, relative quantification of gene expression studies requires preliminary research including the isolation of potential reference genes and the identification of those stably expressed under the biological conditions of interest. In this work four partial gene sequences were isolated from gonad tissue cDNA in the functional hermaphrodite scallop Nodipecten subnodosus to be evaluated as reference genes: 18S-rRNA (18S), riboprotein l8 (rp-l8), actin-β (act-β), and elongation factor 1α (ef-1α), with a fifth partial sequence from an alpha-tubulin (tub-α) found in the libraries also included as a potential reference gene. Stability analysis for the five putative reference genes with geNorm and NormFinder indicated that 18S together with rp-l8 were the most stable genes for normalization of gene expression during gonad development in both, male and female sexual regions of the hermaphrodite N. subnodosus. The least stable gene was tub-α, showing a biased expression profile between sexual regions of the gonad; therefore this gene was analyzed thereafter as a target gene. Relative expression, estimated by normalization with the combination of 18S and rp-l8 as reference genes, indicated that as gonad development advanced, tub-α in the male region was up-regulated pointing toward this gene being a testis-specific α-tubulin isotype. Further analyzes of gene expression among tissues indicated that tub-α is specifically and highly expressed in the male gonad, although expression in adductor muscle was also observed but at significantly lower levels. Tubulins have been extensively used as reference genes, but in this work it was shown that some tubulins might not be suitable as reference genes. Another gene found in the libraries, a putative member of the DEAD-box RNA helicase family (ddx), showed no changes in expression during gonad development or between sexual regions, and was chosen to analyze gene expression and discuss the different statistical inferences resulting from the arbitrary use of ‘randomly-chosen’ reference genes when normalizing gene expression.es_MX
dc.documento.subjectEspermatogenesis; genómica funcional; meiosis.es_MX


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  • Tesis Digitales CIBNOR
    Esta colección contiene texto completo de las tesis de Maestría y Doctorado del Programa de Posgrado del CIBNOR.

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