ELABORACIÓN Y VALIDACIÓN DE UNA HERRAMIENTA MOLECULAR PARA LA DETECCIÓN DE Totoaba macdonaldi

Abstract

"Totoaba macdonaldi es una especie endémica del Golfo de California en peligro de extinción, cuya conservación requiere herramientas eficaces para su monitoreo no invasivo. Una alternativa novedosa es el uso de ADN ambiental (eDNA, por sus siglas en inglés) combinado con técnicas moleculares como la PCR cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés) ofrece una alternativa sensible para detectar su presencia en cuerpos de agua sin necesidad de capturar individuos. Esta tesis tuvo como objetivo diseñar y validar un ensayo molecular especie-específico para la detección de T. macdonaldi mediante pruebas de PCR convencional (cPCR, por sus siglas en inglés) y PCR cuantitativa (qPCR). La validación se desarrolló en tres fases: in silico, in vitro e in situ. En la fase in silico se diseñaron seis pares de cebadores (primers) dirigidos a genes mitocondriales de T. macdonaldi (COI, 12S, CytB, NADH4 y región control). En la fase in vitro mediante cPCR el par SpecTo F1-R2 mostró la mayor especificidad, aunque la presencia de dímeros impidió su estandarización. Posteriormente, en la fase de qPCR se evaluaron la especificidad, eficiencia y sensibilidad de los ensayos, logrando estandarizar tres pares de cebadores (Tma09, Tma10 y Tma13) con eficiencias de 95.2 %, 93.6 % y 100.3 %, coeficientes de determinación R² = 0.997, 0.995 y 0.982 (respectivamente), y límites de detección (LOD, por sus siglas en inglés) y cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) de 8.95X101, 7.7 X100 y 6.9X101 copias/µL, respectivamente. En varios ensayos se detectó co-amplificación con Cynoscion othonopterus, aunque las secuencias obtenidas en muestras artificiales confirmaron amplificación exclusiva de T. macdonaldi en los cebadores Tma09 y Tma10, evidenciando amplificación preferencial hacia la especie objetivo. En la fase in situ, se demostró capacidad para detectar ADN de T. macdonaldi en muestras de agua de estanques y eDNA artificial. Aunque los resultados son alentadores, se reconoce como limitación pendiente la validación en muestras de eDNA marino ambiental. Este trabajo sienta las bases para el desarrollo de herramientas moleculares aplicables al monitoreo de especies acuáticas en riesgo y destaca la necesidad de ampliar las bases de datos genéticas locales para mejorar la especificidad de futuros ensayos. Este trabajo es un primer paso hacia el desarrollo de una herramienta molecular validada para la detección específica de T. macdonaldi."