Caracterización molecular de begomovirus asociados a infecciones mixtas en hortalizas y análisis comparativo del transcriptoma en una planta modelo protegida por construcciones que activan el RNAi ante reto begomoviral

Abstract

"Los geminivirus constituyen una familia de virus infecciosos que afectan a las plantas, tanto de especies silvestres como de áreas de cultivo que se distribuyen en las regiones tropicales y subtropicales y afectan seriamente la producción. Por lo tanto, este estudio realizó la inspección de diferentes cultivos de hortalizas en Baja California Sur, de los que se obtuvo material genético de los begomovirus tomato chino La Paz virus (ToChLPV), tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), cucurbit leaf crumple virus (CuLCrV) y squash leaf curl virus (SLCuV) y de un curtovirus. Se confirmó la identidad de los virus mediante el uso de técnicas de biología molecular, secuenciación Sanger y masiva en las plataformas Illumina. La infección mixta de ToChLPV con TYLCV, de TYLCV con SLCuV, y TYLCV en infección sencilla se confirmó en plantas de tomate. En muestras de plantas de melón y calabaza se confirmó la infección mixta de CuLCrV con SLCuV, mientras que, en muestras de sandía y pepino se confirmó la presencia de SLCuV en infección sencilla. Las muestras analizadas de plantas de chile resultaron negativas a begomovirus. Sin embargo, se confirmó la infección sencilla causada por la especie Beet curly top virus del género Curtovirus, otro miembro de la familia Geminiviridae que se reporta por primera vez en la Península de Baja California. Se obtuvieron 41 secuencias de genomas completos de begomovirus y una de curtovirus. Las enfermedades asociadas a begomovirus están bien establecidas en la región ya que se reportaron por primera vez en 2004. Por esta razón, se realizó la evaluación de plantas de Nicotiana benthamiana protegidas con construcciones que activan el mecanismo de silenciamiento génico. Se compararon los cambios transcripcionales en plantas protegidas con secuencias homólogas CIRP (construcción derivada de la región intergénica del PepGMV) y con secuencias heterólogas CIRT (de ToChLPV) ante el desafío con PepGMV. Los análisis por microarreglos revelaron la regulación de genes asociados al RNAi; la metilación fue inducida por ambas construcciones, observando la participación de DCL2, DCL4, AGO3, AGO7, AGO10, NRPD2B (Pol IV), DRB3, CMT3, RDR6, entre otros. Algunos de estos genes se utilizaron para validar por análisis de RT-qPCR, donde DCL3, DCL4, AGO1-1, AGO2, RDR6 y PPR1 tuvieron mayor expresión en la protección con construcción heteróloga que con la construcción homóloga. De esta manera se confirma la activación del mecanismo de silenciamiento génico a nivel transcripcional, lo que establece la posibilidad de usar este sistema de protección en una infección begomoviral mixta. Finalmente, los fragmentos de secuencias de cinco begomovirus que afectan las hortalizas en BCS se utilizaron para realizar la predicción de siRNAs que activan el mecanismo de RNAi en análisis in silico. De los 1285 siRNAs que se obtuvieron, el 98.6 % hibridaron con los genomas de los begomovirus. También se observó que en todos los casos los siRNAs se unen a secuencias homólogas y heterólogas con una identidad por pares de entre 94.7 y 100 % y son capaces de activar el mecanismo de silenciamiento génico tanto en la infección sencilla como en la mixta."