MICROINYECCIÓN COMO METODOLOGÍA DE ENTREGA DE MATERIAL DE EDICIÓN A TRAVÉS DE CRISPR/CAS9 EN PENAEUS VANNAMEI
Resumen
"Las nuevas herramientas de uso biotecnológico e ingeniería genética como CRISPR/Cas9, son consideradas técnicas revolucionarias que podrían permitir potencializar la mejora genética sostenible de la acuicultura. CRISPR /Cas9 se describe como la acción de una nucleasa (Cas9) guiada por fragmentos cortos de ARN con complementariedad de bases al genoma y como consecuencia, un rompimiento de doble cadena que tendrá que ser reparado. Si bien, CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta de edición genética, esta depende de algunos factores como una entrega exitosa dentro de la célula o embrión, o el tipo de reparación del ADN activado, Non-Homologous End Joining (NHEJ) o Homology-Directed Repair (HDR). El propósito de este trabajo es la implementación de las nuevas tecnologías CRISPR/Cas9 en el crustáceo decápodo Penaeus vannamei, a partir del uso de la microinyección embrionaria como la técnica de acarreo de material de edición. Para la estandarización de esta metodología se evaluaron métodos de reblandecimiento de la pared del huevo, sujeción óptima de los huevos a un sustrato y por último, el diseño óptimo de la aguja para la microinyección, observando con este método supervivencias aproximadas de 3 - 5%. A partir de una co-inyección de sondas donadoras para genes involucrados en el desarrollo de apéndices (Ubx) se observaron algunos fenotipos con malformaciones esperadas por disrupción de dicho gen. Para la verificación genética de las mutaciones resultantes se evaluaron metodologías de enriquecimiento genómico y extracciones de ADN enzimáticas ante el obstáculo que supone las extracciones de los diminutos nauplios individuales. Finalmente, se esperaba que el diseño realizado para las sondas donadoras utilizadas en el sistema CRISPR/Cas9 (ssODN y dsODN), permitiría validar una metodología sencilla para la caracterización del genotipo obtenido mediante la amplificación por PCR a partir de la combinación estratégica de oligonucleótidos y a su vez la determinación del mecanismo de reparación de ADN activado por la célula (NHEJ o HDR). Sin embargo, los resultados arrojan un conjunto de amplicones inespecíficos generados posiblemente a partir del uso de secuencias altamente repetitivas, lo que aunado a la secuenciación lleva a que no es posible concluir sobre la generación de mutaciones. Se propone el uso de secuenciación masiva (NGS) a futuro para verificar las mutaciones generadas."