Transcriptómica asociada a la diferenciación sexual y al arresto meiótico en Nodipecten subnodosus

Abstract

"La almeja mano de león Nodipecten subnodosus, representa un recurso pesquero de importancia a lo largo de la costa del Pacífico, en la península de Baja California, México. Su valor económico se debe al gran tamaño de su músculo aductor, que va desde 65 a 108 g en adultos silvestres, situándolo como un recurso potencial acuícola. Es un molusco hermafrodita funcional, en el cual ambos gametos maduran simultáneamente, aunque la región testicular inicia primero su desarrollo. A diferencia de otros moluscos, en N. subnodosus la inducción a la triploidía resulta en una esterilidad total que representa un obstáculo cuando se busca generar organismos tetraploides para la producción de triploides biológicos, ya que la inducción a tetraploidía depende de primero contar con triploides fértiles en cierto grado. Una de las hipótesis con mayor aceptación sugiere que esta condición de esterilidad podría ser el resultado de la activación de genes de control -checkpoints- de errores durante la meiosis I, los cuales verifican la integridad del genoma, y en su caso inducen un arresto meiótico cuando esta última se ve comprometida. Dado que la presencia de ambos sexos en un único saco gonadal resulta de interés, el presente estudio se centró por una parte en la identificación de genes que participan en la determinación y/o diferenciación sexual de cada región sexual de la gónada (testículo y ovario) y, por otro lado, en la identificación de genes que inducen el arresto meiótico en organismos triploides. Además, se exploró mediante dsRNA la función de los genes blanco dmrt1 y p33 ringo cuya función ha sido asociada a la diferenciación sexual y al control del ciclo celular respectivamente, así como de un control positivo gapdh, en ambos casos empleando ARN de doble cadena (dsRNA). Para el primer objetivo, se secuenció ARN (Illumina MiSeq) a partir de dos estadios de desarrollo (larva con mancha y semilla 3mm), dos tejidos somáticos (músculo aductor y glándula digestiva) y tejido gametogénico representado por la gónada indiferenciada completa, seguido de una reconstrucción de novo del transcriptoma. Del conjunto de genes con anotación ontológica ligada a determinación y/o diferenciación sexual, se seleccionaron diez genes y fueron evaluados por PCR punto final. Cinco de estos genes: Ns-dmrta2, Ns-sox9, Ns-wnt4, Ns-sfrp2 y Ns-sex-1, mostraron expresión mayormente en la región testicular, lo que sugiere una participación en la determinación y/o diferenciación sexual de la región masculina de la gónada. Interesantemente, el gen, Ns-sex-1 es ortólogo del nemátodo C. elegans sex-1 que se expresa en el desarrollo temprano durante la determinación del sexo, el cual da lugar a la condición hermafrodita del nemátodo. Para el segundo objetivo, se secuenció ARN (Illumina NexSeq500) de gónada en la etapa de gametogénesis inactiva e inicial tanto en organismos diploides (2n) como triploides (3n). Para cada condición de ploidía se realizaron análisis de expresión génica diferencial para identificar los genes que se activan durante la gametogénesis inicial. En organismos diploides se encontraron genes asociados a la recombinación homóloga (msh5 y kdm8), organización del huso (nup62), formación del centrosoma (cenp-T), y diferenciación sexual (Ns-dmta2 y pum3). Interesantemente, el gen Ns-dmrta2, involucrado en la diferenciación sexual se encontró altamente expresado. Este gen mostró previamente ser testículo específico, lo que confirma que es uno de los genes más importantes que participan en los eventos de diferenciación sexual en la región testicular de este molusco. En contraste, en organismos triploides (3n), se encontraron genes implicados en la respuesta al daño del ADN y reparación de rupturas de doble cadena (rad51, xpc, myoVI), en la transición de metafase/anafase de la mitosis (slp1 y nuf2), así como inductores y ejecutores de la apoptosis (caspase-3, icad/dffa, bmcc1/prun2). Los resultados observados en organismos triploides al inicio de la gametogénesis sugieren un daño al ADN significativo, probablemente como consecuencia de una reparación fallida de las rupturas de doble cadena durante la replicación del ADN. Estos resultados coinciden con las observaciones previas en las cuales pocos organismos triploides muestran un desarrollo más allá de ovogonia o espermatogonia. Finalmente, el silenciamiento génico por ARN de doble cadena para los genes dmrt1, p33 ringo Speedy y gapdh no mostró disminución del transcrito en ninguno de los genes comparado con los controles. Este resultado coincide con el hecho de que hasta el momento en moluscos se han reportado pocos estudios exitosos empleando dsRNA, lo que podría traducirse en las dificultades de interrogar genes empleando dsRNA en moluscos, incluyendo N. subnodosus."