Aislamiento, clonación y secuenciación de genes que codifican para inhibidores kazal en el camarón blanco (Penaeus vannamei)

Abstract

Los inhibidores Kazal se distinguen por sus relaciones topográficas entre los enlaces disulfuro, la localización del sitio reactivo y que pueden ser de uno o más dominios. Esta familia de inhibidores controla la acción de enzimas serin proteinasas y está involucrada en diversas funciones como la digestión, defensa y acción anticoagulante. El objetivo general de este trabajo fue obtener secuencias que codificaran para inhibidores Kazal en hepatopáncreas de Penaeus vannamei. Se realizó RT-PCR con oligonucleótidos diseñados en base a la secuencia de un inhibidor multidominio de P. monodon y usando como templado el RNA del hepatopáncreas de P. vannamei. Para obtener los extremos se amplificó usando como templado una librería unidireccional de ADNc de hepatopáncreas. El RT-PCR derivó en un fragmento de 223 pb (fragmento A), mientras que las amplificaciones a partir de la librería resultó en tres fragmentos de 256, 222 y 129 pb (fragmento B, C y D). El fragmento A traduce 74 aminoácidos que corresponden a dos dominios parciales de un inhibidor Kazal. El primer dominio posee de la tercera cisteína a la sexta y el segundo dominio de la primera cisteína a la quinta. Se identificó el sitio reactivo a alanina, por lo cual indica especificidad a elastasa. En el fragmento B, 174 pb no son traducibles y contienen codón de terminación, una señal de poliadenilación 12 pb río arriba de la poli (A) que consta 15 pb. El fragmento C codifica desde una parte no traducible que incluye el codón de inicio; el fragmento C y B empalman dando la secuencia completa de un inhibidor con un solo dominio, el cual contiene glicina en el sitio reactivo pudiendo tener una especificidad hacia la enzima elastasa. La mayor homología de la secuencia deducida de los fragmentos C y B fueron con un inhibidor Kazal de anémona que tiene especificidad sobre elastasa. El fragmento D de 129 pb empalma con los fragmentos B y C sin embargo, presenta un salto de 93 pb. El análisis de su secuencia deducida corresponde a una proteína diferente a los inhibidores, que si bien tiene similitudes porque la distribución de las cisteínas es similar a los inhibidores tipo Kazal, no presenta todas las características que la podrían definir como tal. La capacidad de inhibir de los inhibidores encontrados deberá ser confirmada con el aislamiento de la proteína y estudios de cinéticas, ya que no todos los dominios son funcionales. Por otra parte, los inhibidores encontrados son no clásicos, distinguiéndose dentro del mismo grupo por el número de aminoácidos en la parte expuesta hacia la enzima objetivo. Por tanto, es necesario contar con el arreglo tridimensional para establecer relaciones estructura-función además de determinar si desempeña un papel en la actividad en la fisiología de los camarones.