Subclonación de la secuencia que codifica la Cu,Zn SOD-1 en el vector de expresión pPICZ(∝) y producción de la proteína recombinante

Abstract

"Actualmente se emplean microorganismos manipulados genéticamente para portar y expresar genes heterólogos con los que es posible producir proteínas recombinantes de importancia biomédica y/o industrial. El éxito para la expresión de proteínas recombinantes radica en las características y propiedades de la proteína, así como el origen del sistema de expresión utilizado. En los años 80s el uso de levaduras no convencionales (Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, etc.) como sistema de expresión de proteínas de origen eucariota ha sido eficiente, debido a que combina características de ruta secretora de proteínas de eucariotas superiores y, al mismo tiempo, como organismo unicelular es fácil de manipular y cultivar en medios no complejos. El modelo es atractivo por sus altos rendimientos en la producción de biomasa y, frecuentemente, es posible el escalamiento del proceso de fermentación para la sobre-expresión de producto recombinante. La enzima superóxido dismutasa tipo Cu,Zn (Cu,Zn SOD), pertenece a una familia de metaloproteínas que catalizan la dismutación del anión superóxido a oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno. Mediante su actividad catalítica reduce los daños que puede ocasionar el radical superóxido en algunas biomoléculas (ADN, proteínas, lípidos). La enzima tiene un amplio potencial de aplicación dentro del sector biomédico como: antiinflamatorio, medicamento auxiliar en la preservación de órganos susceptibles a transplante, en el tratamiento de ulceras, artritis reumatoide, etc. Además, ha dado excelentes resultados dentro de la industria cosmetológica al retardar el envejecimiento de la piel y como protector contra los efectos de la radiación solar. La Cu,Zn SOD de la levadura marina Debaryomyces hansenii, presenta mayor actividad específica y estabilidad al compararla con la correspondiente obtenida de otras fuentes, como el hígado y los eritrocitos de bovino, y Saccharomyces cerevisiae. La expresión de la secuencia codificante dh sod-1 (Cll5), como proteína recombinante (Cu,Zn SOD de D. hansenii ), fué obtenida al utilizar el sistema de expresión de P. pastoris (levadura metilotrófica), que utiliza los vectores integrativos pPICZ (intracelular) y pPICZ(∝) (extracelular). A la secuencia dh sod-1 se le inserto la caja de Kozac mediante amplificación por PCR, utilizando oligos específicos. El producto se clonó en el vector pCR2.1 utilizando como hospedero E. coli..."