Obtención y análisis de secuencias de genes expresados en hepatopáncreas de Penaeus vannamei a partir de oligonucleótidos diseñados para identificar inhibidores de proteinasas

Abstract

En la actualidad, a pesar de la importancia económica que ha representado el cultivo del camarón en las últimas décadas, no se conoce mucho acerca de su organización genómica básica. Entre las tecnologías de la bioquímica aplicables a la acuacultura está la genómica, la cual permite encontrar genes útiles para el mantenimiento y aprovechamiento de los organismos. Las secuencias expresadas, son una herramienta disponible en la investigación para estudios de fisiología, genética, evolución y mapeo genético de una especie, lo cual con respecto al empleo de prácticas tradicionales en acuacultura proporcionan nuevas perspectivas. Para el presente trabajo se diseñaron seis iniciadores degenerados específicos para detectar transcritos de genes que codifican para inhibidores de proteinasas en el hepatopancreas del camarón blanco Penaeus vannamei. Se utilizaron dos metodologías para cumplir nuestros objetivos. Primeramente, para obtener e identificar los transcritos se sacrificaron camarones obtenidos de un estanque en condiciones optimas de cultivo. Se extrajo ARN de hepatopáncreas y se utilizó como templado en un RT-PCR con todos los iniciadores. Se clonaron los productos amplificados y se secuenciaron clonas positivas. Se obtuvieron 50 transcritos diferentes que codifican al menos para 35 genes distintos. Las proteínas deducidas tuvieron similitudes entre 25% y 50% contra las reportadas en el Banco Genómico de datos del NCBI, sugiriendo la expresión de proteínas de membrana y/o estructurales, además de otras proteínas como la hemicentina, la mucina intestinal de mamíferos, un precursor del factor de coagulación en Takifugu rubipes, algunas proteínas de choque térmico no reportadas para la especie en estudio y proteínas con función aún no descrita en Drosophila melanogaster y en otros artrópodos. Solo dos secuencias, mostraron identidad con secuencias ya reportadas para P. vannamei, una que sugiere una proteína relacionada con el control de la presión de la hemolinfa y la osmorregulación y otra que codifica para la subunidad 18s de ARN ribosomal. Por otro lado, para determinar la expresión de estos genes bajo condiciones de estrés fisiológico inducido, se sacrificaron camarones sometidos a diferentes períodos de ayuno. Se extrajo ARN de hepatopáncreas y se utilizó como templado en un RT-PCR con solo uno de los iniciadores. La electroforesis mostró variación en la expresión de transcritos. Se purificaron 4 amplificaciones de diferente tamaño en gel de agarosa y se secuenciaron con el iniciador especifico. Se obtuvo una secuencia de 154pb no correspondiente a ninguna reportada para inhibidores de proteinasas. Los tres fragmentos restantes mostraron inespecificidad dentro de las secuencias, la cual puede ser justicada por la elevada variación de transcritos encontrada en los productos clonados a partir de las reacciones de RT-PCR realizadas con los 6 diferentes iniciadores. Indudablemente la presente investigación, arroja grandes aportes y perspectivas al conocimiento de la composición genética de P. vannamei y nos da la pauta para iniciar la caracterización de diferentes genes expresados en el hepatopáncreas de camarón, para elucidar ampliamente en las funciones que este órgano realiza.