La determinación del sexo en cetáceos es esencial para el estudio de sus poblaciones, pero en observaciones de campo esta limitada por la presencia de genitales internos y la carencia de dimorfismo sexual en la mayoría de las especies de este orden. Los métodos genéticos usados hasta ahora para la determinación del sexo se limitan a algunas especies, amplifican regiones grandes (300-700 bp) y requieren en su mayoría de ADN de alta calidad. Se desarrollo el ensayo ZFX/ZFY de la 5’ exonucleasa, el cual esta basado en la amplificación de SNP’s (polimorfismos nucleotídicos simples) en los genes ZFX y ZFY. Se utilizaron sondas fluorescentes y oligonucleotidos diseñados de regiones conservadas de los genes ZFX/ZFY de 7 familias de cetáceos. El ensayo obtiene un producto pequeño de 105 pb y permitió determinar el sexo 33 especies de cetáceos de 9 familias distintas de forma rápida y definitiva. Posteriormente, se aplicó este ensayo en 66 muestras de piel descamada de cachalote, tejido que se caracteriza por tener baja concentración y calidad de ADN. El ensayo ZFX/ZFY de la 5’ exonucleasa fue exitoso en piel descamada ya que se amplificó el 83% de las muestras. En conjunto, se asocio la información del sexo con la presencia o ausencia del “callo” de la aleta dorsal para 19 individuos. Se determinó que en mayoría las hembras de distintas clases de edad presentan callo pero también se registro un macho joven con callo. Se utilizaron microsatélites para individualizar 9 cachalotes machos adultos muestreados en el Golfo de California entre 1996 y 2004. No se encontraron recapturas entre éstos machos adultos, lo cual es consistente con la sugerencia de que el Golfo de California representa un área importante de reproducción y crianza para esta especie.In cetaceans sex determination is essential for population studies. But is difficult at field because most species lack sexual dimorphism and have internal genitalia. Previous genetic sexing methods have been limited to a subset of species, and require sampling of high quality DNA. We developed a 5′-exonuclease fluorescent assay based on ZFX/ZFY gene orthologs. This method produces a small 105-bp PCR product. Using primers and sex-specific fluorescent probes designed from conserved regions of seven families, a rapid, highly sensitive, and unambiguous sex determination is available. We demonstrated sex specificity for 33 cetacean species in nine families. We found the ZFX/ZFY 5′-exonuclease assay method highly successful for sloughed skin of 66 samples of sperm whales. This is important because slough skin usually bears low quality or concentration of DNA. Of the 66 sperm whale samples 19 had information on the presence or absence of callus. The animals bearing the callus were mainly females from different age classes but one juvenile male had a callus. Microsatellite markers were used to search for individual identity in adult male sperm whales from the Gulf of California between 1996 and 2004. We did not find individual matches between the adult males that were sampled. These results are consistent with the suggestion that the Gulf of California is an important breeding ground for sperm whales.