Desarrollo de cepa de levadura productora de factores recombinantes que estimulen el sistema de defensa contra infecciones bacterianas

Abstract

Proteínas de membrana externa y otros componentes de superficie de Helicobacter pylori, son las principales moléculas reconocidas por el sistema inmune. El desarrollo de vacunas terapéuticas contra antígenos específicos de H. pylori, ha resultado en beneficios parciales. Se reconoce que el uso de terapias alternativas, el estudio de nuevos antígenos y el desarrollo de nuevas vías de administración, permitirán en un futuro cercano contribuir a la prevención de enfermedades gastrointestinales causadas por esta bacteria. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue estudiar el uso potencial de Saccharomyces cerevisiae para el desarrollo de vacunas orales, que produzcan proteínas antigénicas de membrana externa de H. pylori, involucradas en la adhesión a componentes gastrointestinales. Con la finalidad de diseñar y construir levaduras recombinantes con factores de adhesión de H. pylori, la presente tesis se enfocó en tres objetivos particulares: A) identificar proteínas de membrana de H. pylori 25 que reconozcan a sulfato de heparina (HSBPs), implicadas en la adhesión a células epiteliales, B) clonar y caracterizar molecularmente a los genes que codifican para dichas adhesinas y, C) construir cepas de S. cerevisiae recombinantes que expresen a estas adhesinas antigénicas. Como resultados, se identificó a dos proteínas de membrana externa en la cepa de H. pylori 25, de peso molecular aparente de 47 y 51 kDa, que se denominaron HSBP47 y HSBP51. Ambas proteínas mostraron afinidad por sulfato de heparina, propiedad comúnmente asociada a adhesinas bacterianas. Anticuerpos policlonales producidos contra HSBP47 y HSBP51, inhibieron significativamente la adhesión de H. pylori 25 a células epiteliales in vitro, lo que sugiere que HSBP47 y HSBP51 están implicadas en el proceso de adhesión. Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se amplificaron fragmentos parciales de los genes hsbp47 y hsbp51. Se obtuvo un segmento del gen hsbp47 de 605 pb que codifica para un fragmento de 209 aa. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia nucleotídica indica que el gen hsbp47 tiene un dominio conservado similar al factor de elongación EF-Tu. Por otro lado, para el gen hsbp51 se obtuvo un fragmento de ~ 950 pb el cual revela una identidad del 67% con una proteína hipotética de Y. pseudotuberculosis y del 40% con una proteína hipotética de H. pylori J99. Se subclonaron los genes hsbp47 y hsbp51 en el vector de expresión pYD1 para la construcción de levaduras recombinantes denominadas Aga2-HSBP47 y Aga2-HSBP51. Se evaluó su expresión con la inducción por galactosa a diferentes tiempos, observándose una expresión significativa de la proteína recombinante Aga2-HSBP47, con niveles del 53-51% detectados por ELISA indirecta y un 30% mediante microscopia de fluorescencia Con esta investigación se amplía el conocimiento sobre los mecanismos de adhesión de H. pylori y establece, por primera vez, el potencial uso de levaduras recombinantes con genes que codifican para proteínas antigénicas para el control de infecciones por H. pylori.