Identificación, caracterización y herencia de microsatélites y su aplicación como marcadores moleculares en un programa de mejoramiento de camarón blanco

Abstract

Enmarcado dentro de un programa de mejoramiento genético de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) y con fines de evaluar la variabilidad genética dentro de dicho programa, se identificaron marcadores moleculares tipo microsatélites, abarcando desde su secuenciación, caracterización, diseño de iniciadores, optimización del PCR y análisis de ajuste a una herencia mendeliana. Para caracterizar a los microsatélites se construyó una genoteca parcial Sau3A1 con aproximadamente 2000 clonas. Para identificar a los microsatélites se siguieron dos estrategias: A) secuenciado directo de clonas y B) secuenciado de clonas que hibridaran positivamente con dos sondas biotiniladas (CT)10 y (GT)10. Los microsatélites identificados fueron principalmente dinucleótidos, 58.82 % (1/0.42 kb), seguidos de trinucleótidos, 27.73 % (1/0.88 kb), tetranucleótidos, 9.25 % (1/2.7 kb), y pentanucleótidos, 4.2 % (1/5.84 kb). El microsatélite (CT)n fue el mas abundante seguido de (GT)n, coincidiendo con un reporte previo para esta misma especie, a pesar de que en Penaeus monodon, y en la mayoría de los artrópodos y vertebrados, el dinucleótido (GT)n es el mas abundante. La elevada presencia de una región previamente reportada de un satelite/microsatélite (PVS1) en las clonas (43.33 %), y por ende en el genoma de L. vannamei (1/0.8 kb) disminuyó la probabilidad de identificar nuevas regiones microsatélites, por lo que se propone conformar librerías de DNA genómico cortando con enzimas de restricción (ej. HaeIII, AluI, o HincII, vector SmaI) que no reconozcan tal región. Después de secuenciar 90 clonas (29,199 pb), e identificar 119 regiones microsatélites en 56 de éstas, con una abundancia de microsatélites de 1 cada 0.25 kb, se evaluaron 25 pares de iniciadores diseñados en las zonas flanqueantes de los microsatélites para amplificarlos mediante la “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR). Siete fueron los microsatélites amplificados, de los cuales cinco presentaron claros patrones de bandeo. Los cinco microsatélites amplificados exitosamente por PCR tienen un elevado potencial para la evaluación de variabilidad genética en poblaciones naturales de L. vannamei. De los dos microsatélites más polimórficos (Pvan1758 y Pvan1815) se optimizó la reacción de PCR hasta interpretar correctamente sus diferentes variantes alélicas y genotipos individuales. Ambos loci-microsatélites analizados (Pvan1758 y Pvan1815) se ajustaron a una herencia mendeliana, al evaluar su segregación alélica en la progenie de tres familias, corroborando con el genotipo materno y logrando inferir el genotipo paterno. En el locus Pvan1815, se observaron alelos nulos, lo cual se resolvió al manejar condiciones menos astringentes en el PCR (mayor concentración de MgCl2). Lo anterior aumentó la confiabilidad de estos microsatélites para su posterior aplicación. Los microsatélites Pvan1758 y Pvan1815 se usaron para evaluar la variabilidad genética a lo largo de tres generaciones de camarón cultivado siguiendo una estructura familiar. A partir de organismos de una línea domesticada de Los Melagos Son.-Venezuela (MV) (G0 o población fundadora) se produjeron dos generaciones consecutivas (G1 y G2) de camarón blanco. El propósito de este estudio fue monitorear la variabilidad genética desde la población fundadora hasta la segunda generación, para establecer si los niveles de variabilidad eran los adecuados para proseguir con un programa de selección a largo plazo. La variabilidad genética evaluada en términos de heterocigosidad, tanto observada (Ho) como esperada (He) no cambió significativamente a lo largo de las generaciones (Ho = 0.65 - 0.72; He = 0.77 - 0.71) situándose alrededor del valor observado (Ho) promedio reportado para especies silvestres (0.666) y por arriba del reportado en especies cultivadas (0.594). La variabilidad genética evaluada en número de alelos (nA) mostró un ligero aumento debido a la ganancia de alelos raros, en tanto que en el número de alelos efectivos (ne) se observó una reducción del 16.6 % de G0 a G2. El número de alelos (nA = 7.5 – 10) y el número efectivo de alelos (ne = 4.16 – 3.47) se situó por debajo de lo observado en poblaciones silvestres pero por arriba de lo reportado en poblaciones cultivadas. Se observaron diferencias en frecuencias alélicas en generaciones consecutivas en uno (G0-G1) o ambos loci (G1-G2), debido al aumento y disminución de ciertas variantes alélicas, lo cual puede ser atribuido a la contribución de los machos MV, que en la G0 no fue incluida en el análisis y en la G2 representó una nueva introducción de variabilidad. A pesar de unos niveles de variabilidad genética aceptables en términos de heterocigosidad, los cambios en el número de alelos efectivos (ne) muestran una tendencia previa a permanecer 3 a 4 alelos en ambos loci, lo cual parece indicar que la población fundadora MV ya mostraba una reducción de variabilidad genética, la cual puede ser corregida durante las etapas tempranas del programa de crianza al introducir nuevos organismos con variabilidad genética diferente. Para incrementar la variabilidad genética en G3, varios individuos del programa fueron apareados con reproductores de una línea colombiana. Un análisis preliminar de los reproductores colombianos (n = 23) reveló valores superiores de variabilidad (nA = 10, ne = 6.85, Ho = 0.74, He = 0.87), diferentes frecuencias alélicas, y dos alelos exclusivos en ambos microsatélites que permitirá distinguir entre líneas. El monitoreo de la variabilidad genética demostró ser útil y deberá continuar en este y otros programas, especialmente antes y después de que la selección sea aplicada. La inclusión de otros marcadores genéticos será útil, no solamente para complementar las evaluaciones de variabilidad genética, sino también para el seguimiento de pedigríes y posible asociación con características importantes a nivel de producción (QTLs).