Selección de cepas de Lactobacillus probióticas y caracterización de sus adhesinas de superficie

Abstract

Lactobacillus es un habitante normal del tracto gastrointestinal de cerdos sanos y su presencia ha estado estrechamente relacionada con la salud de su hospedero. Una de las etapas críticas durante el desarrollo de los cerdos la representa el destete. Un decremento substancial en el número de Lactobacillus y un aumento significativo en el número de enterobacterias ha sido reportado durante este período y como consecuencia, las diarreas y otras enfermedades gastrointestinales causadas por patógenos oportunistas son muy comunes. En granjas localizadas en zonas áridas, las condiciones climáticas contribuyen a aumentar el estrés en los lechones. Se ha reportado, que en cerdos expuestos a variaciones de temperatura el estrés causa una disminución en la respuesta inmune y una baja productividad. Por tanto el presente trabajo de tesis se enfocó en dos objetivos principales: 1) Aislar y caracterizar bacterias del género Lactobacillus potencialmente probióticas, dirigidas a mantener la salud de cerdos que habitan granjas localizadas en zonas áridas y durante la etapa del destete, 2) Identificar y caracterizar molecularmente proteínas de superficie involucradas en la adhesión a moco y mucina gástrica de cepas de probióticas. Se aislaron y seleccionaron cepas de Lactobacillus abundantes en heces y en mucosas intestinales en cerdos sanos de la región árida-costera de Baja California Sur. Un total de 164 cepas fueron seleccionadas y su habilidad para crecer a 10, 45 y 50°C y en medio MRS conteniendo 430, 680 y 1112 mM de cloruro de sodio (NaCl) fue evaluada. Los resultados mostraron que 75% de las cepas seleccionadas fueron capaces de crecer a 50°C, mientras que 64% presentó habilidad para crecer en medio adicionado con 680 mM de NaCl. La adhesión a moco y a mucina gástrica fue evaluada en las 164 cepas. Los resultados mostraron que 45% de las cepas aisladas de heces se adhirieron tanto a moco como a mucina mientras que 71% de las cepas aisladas de moco intestinal fue capaz de adherirse. De entre las 164 cepas aisladas, se seleccionó a 27 de estas que presentaron las mejores características de adhesión y de habilidad para crecer a altas temperaturas y en presencia de NaCl. Dichas cepas fueron identificadas a nivel de especie, mediante la secuenciación del gen 16S y de la región intergénica entre los genes 16S-23S del ADNr. Los resultados indicaron que entre las cepas más abundantes en heces se encuentra la especie L. fermentum, mientras que en moco la más abundante fue L. reuteri. Mediante un ensayo cualitativo y cuantitativo, se evaluó la habilidad de las cepas para replicarse en moco intestinal de cerdos, observando que 92.6% de estas es capaz de crecer. Finalmente, se evaluó la habilidad de las 27 cepas seleccionadas para crecer en medio conteniendo 0.3, 2.0, 3.5 y 7.5% de sales biliares. Los resultados mostraron que las 27 cepas crecieron en presencia de 3.5% de sales biliares. Con el fin de identificar proteínas de superficie involucradas en la adhesión de L. fermentum BCS87, se llevó a cabo una extracción de las mismas con cloruro de litio 1M (LiCl). Este extracto protéico fue analizado por western blot utilizando moco y mucina marcados con la enzima peroxidasa. Los resultados indicaron la presencia de dos proteínas de peso molecular aparente de 29 y 32 kDa. El extremo amino terminal y péptidos internos de ambas adhesinas fueron secuenciados. El gen que codifica para la proteína de 32 kDa (32-mmub) se obtuvo por el método de PCR inversa. La secuencia nucleotídica completa, reveló un marco de lectura abierto (ORF) de 903 nucleótidos que codifica para una proteína primaria de 300 aminoácidos y una proteína madura de 272 aminoácidos. Una búsqueda en Blast mostró que dicha proteína presenta porcentajes de identidad de entre 47 y 99% con componentes de unión a soluto en proteínas transportadoras de glicina/betaína, que han sido reportadas en Lactobacillus, Streptococcus y Clostridium. En la secuencia aminoácida deducida de 32-mmub, se identificó un dominio conservado OpuAC dentro del cual se agrupan proteínas bacterianas involucradas con el transporte de moléculas y con la osmo-regulación. Un análisis filogenético hecho con la secuencia de 32-Mmubp y con secuencias miembro de la familia OpuAC, mostró que esta secuencia se encuentra conservada dentro de esta familia. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que animales de granjas localizadas en zonas áridas son una rica fuente de bacterias que poseen potencial probiótico y resistencia a condiciones climáticas adversas. Además la adhesión a moco y mucina que presentó la cepa probiótica de L. fermentum BCS87, parece estar mediada por dos adhesinas de superficie de peso molecular aparente de 29 y 32 kDa. La proteína 32-Mmubp, es un componente de proteínas involucradas en el transporte de solutos que tiene la función adicional de actuar como adhesina en el tracto gastrointestinal de cerdos.