Efecto de altos niveles de vitamina A en la expresión de los genes HOXa5 y RARα, en el desarrollo inicial de Paralabrax maculatofasciatus (Teleostei: Serranidae)

Abstract

La vitamina A (VA) es un nombre genérico que describe a todos los compuestos químicos que presentan la misma actividad biológica que el retinol. La entrada de la VA al núcleo celular esta regulada por la acción de los Receptores del Acido Retinoico (RAR´s). El RA actúa como inductor en la expresión de más de 500 genes, incluidos los genes de la familia Hox. Los factores transcripcionales de los genes Hox son los principales reguladores que controlan el desarrollo embrionario. Particularmente, los genes Hoxa5 regulan la dirección antero-posterior de la región intestinal en vertebrados. Estudios recientes han demostrado que un balance inadecuado de VA puede causar malformaciones en larvas de peces marinos, lo cual impacta en la rentabilidad de los cultivos, debido a las altas tasas de mortalidad y la disminución en la calidad del producto. Dichas malformaciones se cree están asociadas con cambios en la expresión normal de genes implicados en el desarrollo embrionario y en las rutas retinoicas. Por lo que en este estudio se planteó como objetivo general observar los efectos que causan altos niveles de VA en el alimento sobre la expresión de los genes RARα y Hoxa5, implicados en el control del desarrollo inicial de la cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus. Para ello, se realizó un cultivo larvario en un sistema de circulación cerrada ubicado en la Unidad Piloto de Maricultivo (UPIMA) del CICIMAR-IPN. En dicho sistema se utilizaron 6 tanques para llevar a cabo los desarrollos larvarios correspondientes a este trabajo. De los cuales, 3 tanques se utilizaron como controles positivos (sin enriquecimiento del alimento con VA) y 3 tanques se utilizaron para el tratamiento de enriquecimiento del alimento vivo con VA. La alimentación exógena inició a partir de los dos días después de la eclosión (DDE), que es cuando concluye la absorción del saco vitelino en la cabrilla arenera Las larvas fueron alimentadas a saciedad aparente tres veces al día (08:00, 14:00 y 18:00) con rotíferos (Brachionus plicatilis) durante los primeros 15 días. Los siguientes 10 días se alimentaron con nauplios de dos días de Artemia (Artemia sp. Microfeast Artemia Cyst, Burns Philp Foods Inc., Oklahoma, USA). Para culminar alimentándolas con juveniles de Artemia de 5 días hasta los 30 DDE. El alimento vivo fue enriquecido con una emulsión comercial (Super SELCO 3000©). Para el tratamiento con vitamina A, se preparó una solución con 0.6 g de vitamina A (Acetato de Vitamina A, 20,000 UI/g) por cada 500 g de SELCO. Se realizaron análisis por medio de cromatografía liquida de alta resolución para detectar los niveles de inclusión de la VA en el alimento vivo y en las larvas. Se realizó una cuantificación relativa de la expresión genética mediante PCR en tiempo real, utilizando la bioquímica SYBR-GREEN© en un equipo ABI PRYSM 7000 SDS (Applied Biosystems). Se obtuvieron las secuencias parciales específicas de la cabrilla arenera para los genes RARα (384pb. Número de acceso 1088219 NCBI) y Hoxa5 (147 pb. Número de acceso 1088190 NCBI). Los resultados que se obtuvieron en los análisis cromatográficos fueron cualitativos debido muy probablemente a que el nivel de vitamina utilizado resultó ser mucho mas bajo en la práctica que el valor teórico calculado. Asimismo, aunque sí se logró incorporar un poco de vitamina en las presas vivas, es muy probable que cierta cantidad se perdiera mediante desnaturalización por fuentes luminosas y otra cantidad importante por lixiviación dentro de los tanques de cultivo. Por este motivo no fue posible encontrar diferencias estadísticamente significativas entre el crecimiento, así como tampoco entre los patrones de expresión de los genes Hoxa5 y RARα, de los individuos sometidos a los tratamientos. Independientemente de no haber encontrado diferencias entre los tratamientos, si fue posible cuantificar exitosamente los patrones de expresión de los genes. En este sentido, para el caso del gen RARα, se encontró que a los 5 DDE existe una sobre expresión del orden de los 2x que continúa en aumento hasta alcanzar un valor aproximado de 2.5x a los 15 DDE. A partir del día 20, se observa un claro decremento en la expresión llegando a valores estables cercanos al 1.5x hasta los 30 DDE. Posterior a este intervalo de tiempo, a partir de los 20 DDE, se observó un decremento en los valores de la expresión del gen. Los valores de trascripción de los RARα coincidieron en buena medida con los valores de expresión del gen Hoxa5 (2x a los 5 DDE; 2.5x a los 15 DDE; 1.5x.a los 20 DDE; 1x a los 25 y 30 DDE) y dado que los genes Hox se activan en ventanas de tiempo y espacio muy específicas, es posible concluir que la ventana de expresión del Hoxa5 en la cabrilla arenera se encuentra entre los 5 y los 20 DDE. Finalmente, al observar los individuos que presentaron malformaciones, en la mayoría de los casos, éstas se encontraron en la región mandibular. Con estas observaciones, se puede decir que toda perturbación de las vías metabólicas de la vitamina A, afectan la expresión de genes que ésta controla, provocando una alteración en el desarrollo del organismo.