Diseño de métodos moleculares para el análisis de fitoplancton tóxico y nocivo

Abstract

La relevancia del estudio de los florecimientos algales nocivos (FAN), deriva del aumento registrado en el número y frecuencia de dichos eventos en las diferentes zonas costeras del océano mundial. Dentro de este contexto, se han enfocado esfuerzos al establecimiento de sistemas de monitoreo ambiental y biológico en diferentes países, tanto para estudiar las relaciones entre variabilidad ambiental y la presencia y peligrosidad de eventos, como para desarrollar una capacidad predictiva que permita la toma oportuna de medidas preventivas y correctivas. Aún cuando la frecuencia con que se presentan estos eventos en aguas mexicanas va en aumento, en nuestro país los estudios para eficientar el monitoreo biológico y ambiental no ha sido adecuadamente atendido. El método clásico para la detección y enumeración de especies formadoras de FAN, es la observación directa de material vivo o fijado, mediante microscopia de luz. Sin embargo, este proceso es tedioso y lento, y requiere de taxónomos expertos. Para resolver estos problemas, en los últimos años se ha incrementado la atención de la comunidad científica en el uso y desarrollo de técnicas moleculares basadas principalmente en el ADN ribosomal. Como primera fase, se obtuvieron secuencias nucleótidicas de 12 especies de dinoflagelados pertenecientes a los órdenes Gonyaulacales (Alexandrium affine, Alexandrium margaleffi, Gonyaulax spinifera, G. turbiney y Lingulodinium polyedrum, Prorocentrales (Prorocentrum mexicanum, P. minimun y P. lima) y Gymnodiniales (Akashiwo sanguinea, Gymnodinium catenatum -2 variedades- y Cochlodinium polykrikoides); empleando cebadores para dos niveles de especificidad taxonomica (dominio Eukarya y clase Dynophyceae), que flanquean regiones codificantes (Subunidad pequeña SSU, Subunidad grande LSU y 5.8S) y no codificantes (Secuencias intertranscritas ITS1 e ITS2) del ADNr. Las secuencias obtenidas, se confrontaron con las bases de datos mundiales mediante, para determinar, excluir o confirmar la especie, según el caso. Con los cebadores que flanquean la región SSU-ITS-LSU, se confirmó 1 especie (C. polykrikoides), mientras que se generaron 54 nuevos registros, para Akashiwo sanguinea, Gymnodinium catenatum -2 variedades, A. margaleffi, A. affine, G. spinifera, G. turbiney, L. polyedrum, P. lima, P. minimun, y P. mexicanum. Como segunda fase, se utilizaron las secuencias obtenidas para llevar a cabo el diseño de sondas de ADN especie-específicas y cebadores aplicables a la técnica polimorfismo conformacional en hebra simple (SSCP). Se realizaron análisis de alineamiento (programa DNAMAN) para ubicar tanto las regiones variables como las conservadas de las diversas regiones génicas analizadas. Finalmente como tercera fase, se diseñaron 3 parejas de nuevos cebadores, aplicables al formato de hibridación fluorescente in situ (FISH) o blotting y dos aplicables al formato de SSCP.