Caracterización enzimática de la actividad de fenoloxidasa de la hemocianina de Penaeus vannamei

Abstract

La melanosis post mortem es un problema que va en detrimento de las propiedades sensoriales de los crustáceos. El desarrollo de melanina parece depender de fenoloxidasas endógenas sintetizadas en los hemocitos, sin embargo, una proteína más abundante, la hemocianina (Hc), podría estar involucrada y ser más importante. Se investigó la actividad de fenoloxidasa (PO) de la Hc, así como también el mecanismo de conversión y propiedades catalíticas. La Hc del plasma del camarón blanco, Penaeus vannamei, fue purificada y convertida en una proteína con actividad de PO (HcPO) utilizando agentes tanto químicos como enzimáticos; el tratamiento con SDS fue el que generó una mayor conversión. Por su parte, la quimotripsina fue el activador enzimático que mayor tasa de conversión generó. Utilizando electroforesis preparativa, los agregados 6-mer y 12-mer de la Hc fueron purificados, el último agregado fue el que presentó actividad de fenoloxidasa, indicando que la actividad depende también de la forma cómo se conforman las subunidades a nivel cuaternario. La HcPO puede utilizar tanto sustratos difenólicos como monofenólicos. La HcPO presenta óptimos de temperatura (45 °C) y pH (7.6) similares a los que despliegan fenoloxidasas de artrópodos. Tiene una Km de 1.48 mM y una Vmax (x 1000) de 30.5 U/mg cuando se utiliza L-DOPA como sustrato. La Hc es estable al congelado y descongelado a –20 ºC, condiciones a las cuales se sigue observando el desarrollo de melanina. Adicionalmente, la cantidad de potenciales moléculas con actividad de fenoloxidasa derivadas de la hemocianina sugieren que esta proteína puede ser un inductor clave en melanosis post mortem.